论文部分内容阅读
喉癌发病率占头颈部恶性肿瘤的三分之一,是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。仅2012年一年,全球范围内新诊断为喉癌的病例就高达156877例,而有83376名患者在当年死于喉癌。临床上,喉癌的治疗仍然是以手术为主,联合放化疗的综合治疗。而部分患者术后会因为喉部功能损失或彻底失去发声能力而出现严重的生理及心理问题。此外,部分患者还会出现肿瘤局部复发及远处转移。为了保留喉部功能,降低复发或转移的风险,化疗在喉癌的治疗中起到越来越重要的作用。目前已经证实CD133~+的喉癌Hep-2细胞表面的ABCG2蛋白高表达,且该特性导致了喉癌细胞的多药耐药性。同时,已知喉癌细胞表面高表达叶酸受体及癌细胞内多为酸性环境。纳米粒子表面携带正性电荷,极易与携带负性电荷的核酸基团相结合。若以叶酸修饰的MSNs作为抗癌药物和基因治疗分子的载体进行靶向治疗,可期望取得理想的靶向抗癌及化疗增敏效果。【方法和结果】本实验通过探索pH/温度双敏感叶酸化介孔二氧化硅纳米载体作为基因载体的可能性,使其负载siRNA-ABCG2后,通过一系列体内外实验证明该纳米粒子可作为基因载体并成功将基因治疗分子导入细胞内,使基因治疗分子发挥作用,增强化疗药物诱导CD133~+喉癌Hep-2细胞的凋亡作用,逆转其多药耐药性。一、siRNA-MSNs的制备方法及其吸附释放siRNA效率的检测(1)MSNs-DNA的制备。由于RNA分子的不稳定性,本实验应用小片段oligo DNA替代siRNA分子模拟其与MSNs的藕联,从而得出MSNs吸附核酸分子的外界条件。实验发现,将oligo DNA与MSNs与室温下作用6小时后,MSNs可吸附oligo DNA分子。(2)MSNs-DNA对DNA片段的保护性能的检测。MSNs-DNA被DNA酶处理,再将之置于3mol/L的Na Cl溶液中震荡,通过琼脂糖凝胶电泳检测样本中oligo DNA的含量,从而证实了被吸附的DNA分子受到了MSNs的保护,未被DNA酶降解,并在特定条件下可被释放出MSNs外。(3)通过吸附释放比率对siRNA片段进行筛选。从生物公司购买合成了三组备选siRNA片段,使用同样条件和手段使之与MSNs作用后筛选出吸附释放比例最高的一组siRNA片段用于后续实验。二、MSNs负载化疗药物联合导入siRNA-ABCG2诱导CD133~+喉癌细胞凋亡的体外研究(1)CD133~+喉癌Hep-2细胞的分选。应用CD133抗体将Hep-2喉癌细胞进行表面标记,通过流式细胞荧光分选技术将CD133~+的喉癌Hep-2细胞分离出来用于后续实验。(2)FL-MSNs-siRNA的细胞摄取。将负载了siRNA的荧光素(FL)标记过的叶酸化介孔二氧化硅纳米粒子与CD133~+喉癌Hep-2细胞在37℃下共同孵育3小时后,在激光共聚焦显微镜下观察,结果示细胞对其摄取情况良好。(3)MSNs-siRNA对细胞ABCG2表达水平的影响。CD133~+喉癌Hep-2细胞分别经生理盐水、单纯MSNs以及siRNA-MSNs处理后,分别提取总蛋白,应用Western blot方法检测ABCG2蛋白的表达量。结果证实,经siRNA-MSNs处理后,喉癌细胞ABCG2蛋白的表达明显下调。(4)MSNs负载化疗药物联合导入siRNA-ABCG2对CD133~+喉癌Hep-2细胞的体外细胞毒性作用。将六组负载不同治疗基团的MSNs分别作用于CD133~+喉癌细胞:1)负载顺铂的MSNs;2)负载顺铂的MSNs与siRNA-MSNs联用;3)负载5-Fu的MSNs;4)负载5-Fu的MSNs与siRNA-MSNs联用;5)负载紫杉醇的MSNs;6)负载紫杉醇的MSNs与siRNA-MSNs联用。应用MTT法分别检测各组药物的半数致死量(IC50),结果显示,联合用药组的IC50低于单纯应用MSNs负载化疗药物组。三、MSNs负载化疗药物联合导入siRNA-ABCG2诱导CD133~+喉癌细胞凋亡的体内研究:(1)纳米粒子对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用。购置5周龄的BALB/C-nu/nu雌性裸鼠,应用CD133~+喉癌Hep-2细胞进行皮下荷瘤,当肿瘤平均体积达到200mm3后,将裸鼠随机分为8组,按照如下分组,以瘤周注射方式进行给药:1)生理盐水;2)单纯MSNs;3)负载顺铂的MSNs;4)负载5-Fu的MSNs;5)负载紫杉醇的MSNs;6)负载顺铂的MSNs与siRNA-MSNs联用;7)负载5-Fu的MSNs与siRNA-MSNs联用;8)负载紫杉醇的MSNs与siRNA-MSNs联用。测量给药后当天、第3、6、9、12及15天肿瘤的最长径及最短径并计算肿瘤体积,与注射当天肿瘤体积进行对比,根据肿瘤相对体积变化绘制肿瘤生长抑制曲线。结果示,负载化疗药物组与联用组皮下肿瘤的生长均受到了明显抑制,而负载相同化疗药物的MSNs和联用组的肿瘤生长抑制曲线相近。(2)TUNEL法检测肿瘤组织中细胞的凋亡状态。应用TUNEL检测法对肿瘤组织切片进行染色,每个肿瘤随机选取5个视野在光学显微镜下观察并对全部细胞及TUNEL阳性细胞进行计数,计算其凋亡指数(Apoptosis index,AI)。实验结果显示,联合用药组的凋亡指数高于单纯负载药物的MSNs组,且差别均有统计学意义。【结论】本研究将pH/温度双敏感叶酸化介孔二氧化硅纳米粒子作为基因及化疗药物载体,通过上述研究手段证实了其负载基因治疗分子的可能性,同时与负载化疗药物的MSNs联合应用能有效抑制CD133~+喉癌Hep-2细胞ABCG2蛋白的表达,增强了该类喉癌细胞对化疗药物的敏感性,逆转了多药耐药性。