研究背景:认知功能障碍又称为认知功能衰退、认知功能缺损,泛指由各种原因导致的不同程度的认知功能损害,主要影响学习、记忆、理解和解决问题的能力。内分泌激素是由内分泌腺或散在的内分泌细胞分泌的生物活性物质,作为信号分子靶向调控组织或细胞以调节机体的生理功能。目前研究发现多种内分泌激素参与调节脑组织的结构及功能,异常的内分泌激素水平将导致认知损伤。在这些内分泌激素中,甲状腺激素以其在神经系统中的关键作用一直是关注的重点。大量临床证据表明甲状腺功能异常疾病与认知损伤密切相关。基于甲状腺激素从发育阶段到衰老阶段对神经细胞生长及胶质细胞生长的关键作用,甲状腺功能异常疾病与认知损伤的相关关系往往归结于异常的甲状腺激素水平。然而,亚临床甲状腺功能亢进症与认知损伤相关的临床证据在不断增加。亚临床甲状腺功能亢进症是指血清甲状腺功能激素水平在正常参考范围内,而促甲状腺激素(Thyroid stimulating hormone,TSH)低于正常参考范围下限的临床疾病。亚临床甲状腺功能亢进症的主要危害为心血管疾病、痴呆、骨质丢失及骨折等。在认知功能方面,人群前瞻性队列研究的荟萃分析发现亚临床甲状腺功能亢进症与痴呆风险的增加有关。此外,临床系统评价也为亚临床甲状腺功能亢进症与认知损伤增加的相关性提供了可靠证据。亚临床甲状腺功能亢进症患者的甲状腺激素水平正常,无法用传统的观点解释上述现象,因此目前尚没有明确的机制解释亚临床甲状腺功能亢进症与认知损伤的关系。由于TSH是亚临床甲状腺亢进症的特征性变化指标,同时多个临床研究表明低水平的TSH与认知损伤增加相关,这提示TSH可能参与调控认知功能。TSH是垂体前叶合成及分泌的一种内分泌激素,是由α-糖蛋白亚基和特异性的β亚基非共价连接组成的糖蛋白异二聚体。TSH是结合膜蛋白质类的G蛋白偶联受体超家族成员—促甲状腺激素受体(Thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)的主要配体。TSH的经典作用是通过结合甲状腺细胞基底外侧膜的TSHR,通过环磷酸腺苷激活细胞内信号转导,并且进一步诱导磷脂酶C和蛋白激酶A信号转导系统,刺激甲状腺合成及分泌甲状腺激素。近年越来越多的研究发现,TSHR不仅仅局限表达于甲状腺组织,在肝脏、皮肤、心脏、骨骼等多个甲状腺外组织均有表达并发挥作用,TSHR信号通路的甲状腺外调控作用日益被重视。海马组织作为边缘系统的一部分,是编码、巩固、提取记忆的核心脑区,其在语义情景记忆、新事物探索、空间导航等方面发挥关键作用。在中枢神经系统中,目前已发现TSHR存在于整个边缘系统的神经细胞体,同时研究已证实海马组织及脑脊液中均具有TSH,然而TSHR信号通路对脑功能的作用仍待明确。基于上述临床及基础研究的证据,本课题拟从人群研究出发,利用基因敲除动物模型,从行为学、组织病理学、基因表达谱等多角度论证TSHR信号通路对认知功能的调控作用,并阐明核心突触相关分子对TSHR信号通路缺陷所致认知损伤的重要作用。为亚临床甲状腺功能亢进症与认知损伤的相关性提供了新解释,也为甲状腺疾病和认知功能损伤的预防及治疗提供了更多的理论依据。研究目的:1.探究TSH与认知功能损伤之间的关系。2.阐明TSHR信号通路对认知功能、海马组织病理结构及基因表达谱的影响。3.揭示基因表达谱中核心分子在TSHR信号通路缺陷所致认知功能损伤的重要作用。研究方法:1.人群横断面研究:为全国性流行病学调查“中国2型糖尿病患者恶性肿瘤发生风险的流行病学研究(Risk Evaluation of Cancers in Chinese Diabetic Individuals:a Longitudinal Study,REACTION)”项目的一部分。每个研究对象接受标准的问诊、体格检查、采集空腹血以及完成简易智力状态检查量表。采集研究对象空腹静脉进行甲状腺功能指标检测,包括游离三碘甲腺原氨酸(Free triiodothylamine,FT3)、游离甲状腺素(Free thyroxine,FT4)和TSH,检测方法为电化学发光法。2.动物模型:2.1 Tshr基因敲除小鼠模型:Tshr杂合子(Tshr+/-)小鼠之间交配繁殖,获得纯合子(Tshr-/-)小鼠与野生型同窝对照(Tshr+/+)小鼠用于实验。由于Tshr-/-小鼠缺失TSHR,小鼠出生后给予外源性甲状腺激素补充以保证血清甲状腺激素处于正常水平。2.2 7,8-二羟基黄酮(7,8-Dihydroxyflavone,7,8-DHF)给药模型:使用上述Tshr基因敲除小鼠模型,纯合子(Tshr-/-)小鼠之间交配后获得纯合子(Tshr-/-)小鼠用于实验。小鼠出生后给予外源性甲状腺激素补充以保证血清甲状腺激素处于正常水平。为研究脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在TSHR信号通路缺陷所致认知损伤中的作用,对3月龄Tshr-/-小鼠分别通过饮水给予BDNF模拟物7,8-DHF(7,8-DHF组)和溶媒(Veh组)连续8周。3.放射性免疫分析法:用于检测血清总三碘甲腺原氨酸及总甲状腺素。4.行为学实验:应用Morris水迷宫(包括定位航行实验、空间探索实验)及Y迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力。5.免疫荧光技术:用于检测TSHR在海马中的表达及分布状况。6.免疫组化技术测定各种分子蛋白水平的表达:NEUN,FOS,EGR1。7.尼氏染色法:用于检测尼氏小体,观察海马的基本神经结构。8.高尔基染色法:用于观察海马神经元结构及树突棘的数目。9.透射电镜观察:用于观察海马组织突触的数目及超微结构。10.转录组学测序分析:用于检测海马组织基因表达谱,并对差异基因进行生物信息学分析。11.RNA提取及实时荧光定量PCR检测各种分子mRNA水平的表达:Actb,Arc,Bdnf,Cebpb,Fos,Egr1,Egr2,Grin2a,Homer1,Itpr1,Junb,Kcnab1,Klk8,Npas4,Ppp3ca,Shank3,Tanc1,Tshr。12.蛋白提取及免疫印迹法测定BDNF蛋白水平的表达。13.统计学分析:13.1人群研究:计量资料根据其是否符合正态分布采用均数±标准差或中位数(四分位数间距)进行描述。组间比较采用单因素方差分析或Kruskall-Wallis检验进行比较,单因素方差分析事后多重比较采用Bonferroni检验。计数资料采用绝对数(率)进行描述,组间比较采用卡方检验。p<0.05认为有统计学意义。采用二元logistic回归模型分析血清TSH水平与认知功能损伤的关系,TSH各分组以第四组(Quartile4)作为参考进行比较。应用SPSS 22.0软件进行上述数据分析。13.2基础研究:计量变量以均数±标准差或标准误表示。两组间比较使用独立样本t检验方法,采用双侧检验,以p<0.05认为有统计学意义。使用Graphpad prism 6.0软件进行统计分析及作图。研究结果:1.人群血清低水平TSH是认知功能损伤的危险因素人群横断面研究的受试者根据血清TSH水平进行分层,进行二元logistic回归分析。分析结果发现与最高TSH组(Quartile 4)相比,最低TSH组(Quartile 1)的认知损伤风险约增加2.1倍,表明血清低TSH是认知功能损伤的危险因素。2.海马组织存在TSHR的表达免疫荧光实验结果证明TSHR在小鼠海马组织的DG、CA1、CA3亚区均有表达。3.Tshr基因敲除导致小鼠的空间学习记忆能力降低在Morris水迷宫实验中,定位航行实验发现Tshr--小鼠游泳距离较同窝对照野生型小鼠显著增加,表明其空间学习能力降低。空间探索实验发现Tshr-/-小鼠跨越平台次数显著减少,目的象限游泳时间所占百分比等指标显著降低。空间探索实验游泳路径显示,不同于同窝对照野生型小鼠游向目的象限并重复跨越原平台位置,Tshr-/-小鼠运动轨迹表现出无目的性且倾向于边缘化,表明Tshr基因敲除导致小鼠的空间参考记忆能力受损。在Y迷宫实验中,连续交替实验发现Tshr-/-小鼠自发交替反应率显著低于同窝对照野生型小鼠,表明Tshr基因敲除导致小鼠的空间工作记忆受损。4.Tshr基因敲除引起海马组织CA1区锥体神经元树突棘密度降低及突触超微结构改变尼氏染色结果显示,Tshr-/-小鼠与同窝对照野生型小鼠相比,同一水平切面海马组织大致形态结构及横截面积未见与显著差异。以神经元标记物NEUN标记神经,进行免疫组化染色,实验结果显示,Tshr-/-小鼠与同窝对照野生型小鼠两组间海马组织CA1、CA3、DG区的NeuN阳性染色细胞数均无显著差异,提示Tshr基因敲除对海马组织的大致形态及成熟神经元数目无显著影响。高尔基染色结果显示,Tshr-/-小鼠的海马CA1区锥体神经元的顶端树突及基底树突的树突棘密度显著低于同窝对照野生型小鼠。透射电镜观察发现,与同窝对照野生型小鼠相比,Tshr-/-小鼠的海马CA1区非对称性突触(兴奋性突触)及穿孔突触的密度显著降低。在兴奋性突触的超微结构方面,Tshr-/-小鼠的突触后膜致密物PSD厚度显著降低,突触间隙距离显著增加。5.Tshr基因敲除导致海马组织基因表达谱的改变对Tshr-/-小鼠与同窝对照野生型小鼠两组间海马组织进行基因差异表达分析,共有438个差异基因,包含188个上调基因和250个下调基因。主成分分析发现两组小鼠组内样本相对聚集、重复较好,组间差异大,可分为两个相对独立的群。对差异基因进行GO富集分析及KEGG通路富集分析,结果表明排名靠前的GO term和KEGG通路富集均为突触相关组分或者突触传递信号通路。6.Tshr基因敲除导致海马突触相关基因mRNA及蛋白表达量改变生物信息学分析结果显示,分布在互作网络中心位置的关键基因一部分是突触相关基因。通过Real-time PCR进行突触相关差异基因的mRNA表达水平验证,Tshr-/-小鼠较同窝对照野生型小鼠海马组织的Egr1,Junb,Egr2,Arc,Fos,Bdnf和Naps4基因的mRNA转录表达量显著下调,与RNA-seq结果一致。进一步对上述互作网络的关键基因进行蛋白水平的验证,Western blot结果显示,Tshr-/-小鼠较同窝对照野生型小鼠海马组织的BDNF水平显著降低。免疫组化染色结果显示,Tshr-/-小鼠海马组织的FOS阳性细胞数在CA1、CA3、DG区显著减少,EGR1阳性细胞数在海马组织的CA3及DG区显著减少。7.小分子BDNF模拟物7,8-DHF可改善Tshr基因敲除小鼠的空间学习记忆能力基于BDNF处于互作网络中关键基因的核心位置,为研究BDNF在TSHR信号通路缺陷所致认知损伤中的作用,我们对3月龄Tshr-/-小鼠分别通过饮水给予BDNF模拟物7,8-DHF(7,8-DHF组)和溶媒(Veh组)连续8周。Morris水迷宫发现,与Veh组相比,定位航行实验中7,8-DHF组小鼠较Veh组小鼠寻找平台的潜伏期显著减少同时游泳距离显著减少,空间探索实验中7,8-DHF组小鼠跨越平台次数显著增加。空间探索实验游泳路径显示,不同于Veh组小鼠,7,8-DHF组小鼠游向目的象限并重复跨越原平台位置,表明7,8-DHF可显著改善Tshr基因敲除小鼠的空间学习记忆能力。研究结论:1.血清低水平TSH是认知功能损伤的危险因素。2.TSHR信号通路缺陷可导致空间学习记忆能力降低,海马组织病理结构及基因表达谱改变。3.BDNF的下调是TSHR信号通路缺陷所致认知功能损伤的重要分子机制。