TαBTF3基因在小麦中的克隆及其功能研究

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本文采用cDNA末端快速扩增法(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE),在小麦中首次克隆出BTF3基因(命名为TaB TF3)的序列全长,并采用VIGS(Virus-inducedgene silencing,VIGS)技术对其进行基因功能鉴定。  主要研究结果如下:  1.采用RACE-PCR技术从小麦中首次克隆到TaBTF3基因,其cDNA序列全长882bp,最大ORF序列为534bp,该基因编码一个由177个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为20KD。基因组DNA序列全长1742bp,包含5个外显子、4个内含子,内含子和外显子的剪切位点严格符合GT/AC规律。实时定量PCR检测表明,TaBTF3在小麦根、叶、叶鞘、旗叶和幼穗中均有不同程度的表达,在旗叶中表达量最高,且受PEG、冷(4℃)、NaCl、MeJA、ABA和SA诱导上调表达。蛋白亚细胞定位结果表明,TaBTF3蛋白主要定位于细胞核与细胞质。Southern杂交结果显示,TaBTF3是多拷贝基因,以多拷贝的形式存在。  2.选用大麦条纹花叶病毒(BSMV)载体,在豫麦34中成功沉默报告基因TaPDS(小麦八氢番茄红素脱氢酶基因),TaPDS-VIGS小麦植株叶片呈现明显的光漂白表型。GFP蛋白荧光检测结果表明,在BSMV-GFP植株的叶片与根系中均可以检测到较强的GFP荧光信号,BSMV诱导的基因沉默是系统性沉默,并不仅仅局限于接种叶片。高效稳定的小麦VIGS技术体系的成功建立,为小麦TaBTF3基因功能分析验证提供了技术平台。  3.成功获得TaBTF3-VIGS植株与BSMV-GFP对照植株,并对BSMV-VIGS植株进行鉴定、生理指标检测。沉默TaBTF3基因导致叶绿素含量降低、MDA与H2O2含量显著升高。通过荧光定量PCR检测线粒体、叶绿体编码基因的表达量变化,结果表明,与BSMV-GFP对照植株相比,沉默TaBTF3基因导致线粒体、叶绿体编码基因的表达量显著下降。进一步采用石蜡切片技术观察TaBTF3-VIGS植株叶肉细胞的变化,结果显示,与对照相比,TaBTF3-VIGS植株的叶肉细胞发育异常、体积变小、排列松散、无序、胞间隙较大。由此表明,TaBTF3可能与线粒体、叶绿体和叶肉细胞的生长发育有关。  4.通过荧光定量PCR检测小麦逆境相关基因的表达量,并对TaBTF3-VIGS植株与BSMV-GFP对照植株进行胁迫耐受性检测。结果表明,在正常生长条件下,沉默TaBTF3基因导致逆境相关基因的表达被抑制。逆境胁迫处理结果显示,TaBTF3-VIGS植株的相对电导率与失水率显著高于对照,而相对含水量与游离腩氨酸含量则明显降低。沉默TaBTF3降低了小麦植株对干旱和冻害胁迫的耐受性。这些结果表明,TaBTF3参与了植物逆境胁迫耐受性过程。
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大豆是我国重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物,也是植物蛋白质的主要来源,但目前我国大豆生产供不应求,进口量急剧增加,大豆产业面临着严峻的挑战。大豆生产常受到病虫害的威胁,而大豆胞囊线虫病是危害最严重的病害之一。目前防治大豆胞囊线虫通常采用轮作、杀线虫药剂、生物防治和应用抗线虫品种等措施,但存在一定局限性。随着植物与寄生线虫之间相互作用机制的深入研究以及分子遗传操作技术的逐渐成熟,利用基因工程技术构