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Beta-连环蛋白(β-catenin)是一种具有多种功能的蛋白,可以调节细胞间黏附和作为Wnt/β-catenin信号通路的关键分子调控基因转录,发挥多种生物学功能。β-catenin在细胞的不同部位中具有不同作用,在细胞膜表面可以与E-钙粘蛋白(E-cadherin)结合,使细胞之间形成稳固的粘连,维持细胞间或组织间的结构；在胞浆中,一部分β-catenin黏附在钙粘蛋白上,其余的结合在腺瘤性结肠息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli,APC).糖原合成激酶3p(glycogen synthetase kinase,GSK3β)和轴蛋白(Axin)共同构成的蛋白复合物上,发生磷酸化后被降解。Wnnt信号激活时,β-catenin会进入细胞核结合T细胞因子和淋巴增强因子的复合物(TCF/LEF),促进原癌基因c-myc和细胞周期蛋白D1(cyclin-D1)等下游靶基因的表达,使细胞发生恶性转化,来影响细胞的发育、增殖、凋亡等行为。越来越多的研究表明,β-catenin的异常表达及核转移与人类多种肿瘤性疾病相关,如肝癌、结肠癌、乳腺癌等。目前对β-catenin的研究主要集中于人类肿瘤性疾病的研究,而家禽肿瘤性疾病如禽白血病、马立克氏病中β-catenin的生物学功能研究鲜有报道。家禽肿瘤疾病的发生发展是否与Wnt/β-catenin信号通路激活相关尚不清楚。因而本研究通过制备抗家禽β-catenin亲和层析多克隆抗体,构建β-catenin标准品质粒,建立检测家禽β-catenin实时荧光定量PCR方法,为家禽肿瘤性疾病中β-catenin的检测提供了良好的技术手段。同时,通过抑制剂的使用,观察β-catenin在细胞中的定位是否发生变化,并检测病毒感染鸡组织及鸡的肿瘤组织中Wnt/β-catenin信号通路关键基因的表达情况,为进一步研究家禽肿瘤性疾病与Wnt/β-catenin信号通路的关系提供理论依据。1.抗家禽beta连环蛋白亲和层析多克隆抗体的制备及鉴定为制备能结合家禽beta-连环蛋白(β-catenin)的特异性多克隆抗体并进行生物学鉴定,根据GenBank中公布的β-catenin序列,经生物软件比对分析筛选出一段抗原性好的序列合成多肽。将该多肽与KLH载体偶联免疫新西兰兔。免疫血清经亲和层析后制得纯化的多克隆抗体,并利用Western blot、间接免疫荧光、免疫组化方法对抗体进行生物学鉴定。制备的抗家禽β-catenin多克隆抗体可有效检测家禽细胞中天然的β-catenin蛋白,表明成功制备了抗家禽β-catenin亲和层析多克隆抗体。2.家禽beta-连环蛋白基因绝对荧光定量PCR检测方法的建立根据GenBank中公布的原鸡beta-连环蛋白(β-catenin)基因序列,设计一对特异性引物,以CEF细胞中提取的总RNA为模板,扩增出β-catenin基因,将扩增片段与pGEM-TEasy载体连接。测序正确后将目的基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,双酶切鉴定正确后,将该真核表达重组质粒作为标准品质粒。利用软件设计家禽β-catenin的荧光定量PCR引物,建立检测β-catenin勺实时荧光定量PCR方法。利用该方法检测一日龄SPF鸡不同组织中β-catenin基因的分布和表达情况。结果表明β-cate nin基因在一日龄雏鸡脑组织中表达水平最高,法氏囊中表达水平最低。本研究成功构建了β-catenin基因标准品质粒及建立了检测β-catenin基因的绝对定量PCR方法,为进一步研究β-cate nin的生物学功能提供了技术手段。3.家禽细胞中beta-连环蛋白的定位研究为研究家禽beta-连环蛋白(β-catenin)是否和哺乳动物细胞中的β-catenin一样,正常情况下在细胞胞浆中被降解,当胞浆中集聚时会向细胞核转移。本研究使用GSK3β抑制剂(GSK3β inhibitor)和LiCl分别处理CEF和DF1细胞,间接免疫荧光方法观察β-catenin在细胞中的定位情况。设计针对Wnt/βcatenin信号通路关键基因的特异性引物,通过real-time PCR检测信号通路下游基因的表达情况。实验结果显示,GSK3β inhibitor和LiCl分别处理细胞24h或48h后都发现细胞中的β-catenin向细胞核转移的现象,从而导致在DF1细胞中β-catenin基因表达量升高,在CEF细胞中LEF和WIF基因表达量升高。结果表明家禽β-catenin与哺乳动物的β-catenin一样,正常细胞中处于降解状态,当细胞受到刺激后在胞浆中集聚,并发生细胞核转移。4.鸡组织脏器中Wnt/β-catenin信号通路关键基因表达检测及定位为研究Wnt/β-catenin信号通路与家禽肿瘤性疾病的关系,本研究提取感染病毒鸡组织、临床鸡肿瘤组织及相同日龄SPF鸡组织的RNA并反转录为cDNA,使用针对Wnt/β-catenin信号通路关键基因的特异性引物,通过real-time PCR检测相关基因的表达情况。取病毒感染鸡的组织进行β-catenin的免疫组化。结果显示在ALV-J感染的动物肾脏中,β-catenin基因在第4、8、12周表达量比同日龄SPF鸡高。在第8周龄的肾脏中,仅JUN表达量降低,其他基因表达量均升高。在临床肝脏肿瘤组织中,β-catenin表达量均升高,WIF检测不到；在临床肾脏肿瘤组织中,大部分LEF表达量升高,一组WIF表达量异常升高。在临床MDV肝脏肿瘤组织中,仅TCF7基因表达量下降,WIF未检测到；但在临床MDV肾脏肿瘤组织中,TCF7和WIF明显升高。大部分检测结果中都出现了β-catenin和LEF表达量升高。WIF基因在肝脏组织中检测不到,但在肾脏组织中表达量异常升高。免疫组化结果显示β-catenin在脾脏、肾脏和心脏中出现了细胞核阳性着色。提示在家禽肿瘤性疾病——马立克氏病和禽白血病中,Wnt/β-catenin信号通路可能发挥了一定的作用。