研究背景和目的阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年痴呆症的最常见原因,在65岁以上的老年人中的发病率约为5%,而且年龄每增长5岁,其发病率即增高一倍。AD的特征性病理改变包括神经纤维缠结,其主要成分为不溶性的高磷酸化状态tau蛋白,和老年斑,其主要成分为不溶性的Ap沉积物。研究发现,AD患者大脑海马区域神经元高表达Dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase1A (DYRK1A)。DYRK1A是果蝇Minibrain kinase (MNB)的人类同源体,在生长、发育及胚后期神经生成的调控中发挥重要作用。多项研究表明,DYRK1A的高表达尽管并不是造成AD神经病理学改变的充分条件,却是必不可少的因素,其参与了APP的过度磷酸化、tau蛋白的形成,亦参与了APP的酶解过程,促进细胞内Aβ的生成。此外,DYRK1A通过磷酸化含有RPX(S/T)P共同氨基酸序列的底物,参与多种病理生理过程。由于DYRK1A具有基因剂量效应,研究DYRK1A在转录水平的调节具有重要意义。神经元限制性沉默因子,RE-1silencer of transcription factor (REST; also known as neuron-restrictive silencing factor, NRSF)通过与神经元限制性元件(neuron-restrictive silencer element, NRSE)结合,在转录水平调节神经元性基因的表达。REST/NRSF主要在神经前体细胞和非神经细胞中表达。但近年来的研究表明,在中枢神经系统,尤其是海马,存在REST/NRSF的高表达。DYRK1A和REST/NRSF在海马的共同表达为我们研究REST与DYRK1A的相互作用提供了理论依据。目前,国内外关于DYRK1A在AD发病机制中的研究方兴未艾,其中涉及最多的是DYRK1A的磷酸化作用对tau蛋白及Ap生成的影响。已有研究表明,DYRK1A剂量的升高或降低均造成REST mRNA含量的降低,而对于DYRK1A剂量对REST蛋白的影响及可能作用机制却无相关研究。关于DYRK1A转录调节作用的研究仅有2篇文献,但并没有转录因子REST对DYRK1A转录调节方面的研究。由于DYRK1A具有基因剂量效应,过量和低表达的DYRK1A对机体都有不利影响。本课题通过研究DYRK1A与REST蛋白的相互作用,进一步认识二者在AD病理生理机制中的重要作用,以期望能发展新的治疗方法。材料和方法1.细胞培养：共培养了HEK293、C6、PC12、N2a四种细胞,用作后续试验。2. REST对人类DYRK1A基因的转录调控：通过PCR从人类基因组得到DYRK1A全启动子区域并利用合适的酶切位点,将其连入不含有启动子的pGL3-Basic载体中；在HEK293细胞中无或有REST存在的情况下,观察该启动子的活性变化；使用RNAi技术,将HEK293细胞内源性REST敲除后,提取细胞总RNA,使用半定量RT-PCR技术,观察HEK293细胞中REST高表达与敲除时DYRK1A mRNA的变化,并使用一个公认的能被REST抑制的靶基因-BDNF基因,作为验证基因；在HEK293细胞中高表达REST48小时后,提取细胞总RNA,用Taqman实时荧光定量RT-PCR检测DYRK1A mRNA表达水平,并在鼠源性C6和N2a细胞中使用半定量的方法进行验证；将该启动子与DYRK1A的表达载体与RNAi在N2a细胞中共表达,观察DYRK1A对自身剂量变化的反应。3. DYRK1A基因启动子区的功能性NRSE位点的确定：在线启动子软件分析显示DYRK1A启动子区域含有3个预测的转录因子REST结合元件-NRSE。构建含有人类DYRK1A基因不同启动子区域的载体,将其分别转染入表达REST的C6细胞和基本不表达REST的PC12细胞中,采用双荧光报告系统检测由于REST表达量的差别而造成的其在这两种不同细胞系中的启动子活性变化趋势,寻找转录因子REST对DYRK1A基因可能的调控位点,并在PC12细胞系中共转REST表达载体与各个启动子片段,验证这种变化趋势；采用凝胶迁移率试验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)实验分别从体外和体内两种途径验证双上述实验找到的功能性NRSE位点。4.检测DYRK1A与REST在C57BL/6小鼠大脑发育过程中及在不同细胞系中的表达情况：使用免疫荧光技术检测DYRK1A与REST蛋白在正常成年小鼠海马和大脑皮层的表达情况；取胚胎(embryonic)E13、E17及生后(postnatal)P1、P7、P14、P30小鼠的大脑,提取组织总RNA,采用实时定量荧光PCR技术检测用Dyrk1a与Rest mRNA的含量；提取培养的PC12、 C6、N2a细胞总RNA,使用半定量RT-PCR技术,检测Dyrk1a与Rest mRNA在不同细胞系的表达情况。5.在鼠源性细胞系中检测DYRK1A蛋白的表达升高与敲除对转录因子REST表达的影响及其作用机制：构建DYRK1A的小干扰RNA (siRNA)并在N2a和HEK293中验证其干扰作用；将DYRK1A的表达载体及siRNA分别转染入N2a细胞,48小时后提取细胞总RNA,并采用半定量RT-PCR方法检测内源性Rest mRNA的表达变化；将DYRK1A的表达载体及siRNA与REST表达载体共转,western blotting检测REST蛋白的表达变化,并使用蛋白合成抑制剂cycloheximide (CHX)处理,观察蛋白降解速度,以确定DYRK1A剂量变化对REST蛋白造成的影响与REST蛋白的降解之间的关系；由于REST蛋白的降解与其C末端的泛素化有关,我们将泛素表达载体、REST表达载体和DYRK1A的表达或干扰载体共转入HEK293细胞中,用泛素抗体(Ubi)作为免疫沉淀的抗体,用REST抗体做western检测,观察DYRK1A高或低表达对REST泛素化程度的影响,并构建了不含有C末端的REST表达载体,与DYRK1A的表达或干扰载体共转入HEK293细胞验证这种影响。6.检测REST转录活性是否受到DYRK1A剂量的影响：我们使用公认的可以被转录因子REST下调的靶基因-BDNF来反映REST的转录活性。当在N2a细胞中转染DYRK1A的表达载体和干扰siRNA时,我们分别从mRNA和启动子活性水平观测BDNF基因受到的影响；并在无和有外源性REST蛋白存在的情况下,提取受到DYRK1A的高表达和干扰处理的N2a细胞核提取物,采用使用凝胶迁移率试验(Electrophoretic mobility shift assay, EMS A)观测REST蛋白与其靶序列的结合能力变化。结果1.REST可以激活人类DYRK1A基因的转录：将PCR得到的人类DYRK1A基因启动子区域连入pGL3-Basic载体后并转染入HEK293细胞,发现此启动子有较高的活性;将REST表达载体与此启动子共转,发现REST高表达可使其活性显著增高；相对于BDNF mRNA在REST高表达时的降低,半定量RT-PCR结果表明REST高表达可以明显升高人类DYRK1A基因mRNA水平,而REST的敲除则导致DYRK1A mRNA的明显降低,并在鼠源性的PC12和C6细胞系中得到进一步的验证；实时定量PCR亦发现REST可明显升高DYRK1A mRNA表达；DYRK1A基因的启动子活性在DYRK1A高表达或干扰时均降低。2.人类DYRK1A基因启动子区的-833to-815bp可与REST结合,发挥功能性神经限制性沉默元件(neuron restrictive silencing element, NRSE)的作用：人类DYRK1A基因启动子区的3个预测NRSE位点分别是：-833到-815bp对应第一个NRSE位点(NRSE-DY1),-644到-626bp对应第二个NRSE位点(NRSE-DY2),-550到-534bp对应第三个NRSE位点(NRSE-DY3)。双荧光报告系统结果显示,在BDNF基因上游包含NRSE位点的pBDNFluc在PC12细胞中的活性明显高于C6细胞,含有DYRK1A启动子区-833到-815bp的载体在C6中有更高的活性,而去掉-833to-815bp的启动子片度载体在PC12和C6细胞中则没有这种差异；共转REST表达载体和DYRK1A启动子载体的PC12细胞也显示,REST表达可降低pBDNFluc的活性,升高含有-833到-815bp的DYRK1A启动子载体的活性；凝胶迁移率试验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)实验结果也显示第一个NRSE预测位点(人类DYRK1A基因-833到-815bp)可以与REST结合,导致REST对DYRK1A基因的上调。3. DYRK1A和REST共同表达在正常成年小鼠大脑、神经发育过程和不同细胞系中：免疫荧光检测发现,DYRK1A和REST蛋白共同表达在正常成年小鼠的海马神经元和大脑皮层神经元；实时定量荧光PCR发现Dyrk1a和Rest mRNA在E13、E17、P1、P7、1P14、P30小鼠大脑中的表达变化趋势亦一致,均在P7至P14处于较高水平,而在P30表达水平下降,但仍然可以检测的到；Dyrk1a mRNA在含Rest mRNA较高的C6和N2a细胞系中表达较高,而在Rest mRNA含量非常低的PC12细胞系中几乎检测不到。4. DYRK1A的表达升高与敲除均可以下调转录因子REST的表达水平：构建针对鼠源性Dyrk1a的小干扰RNA (psi-DY)并在N2a细胞中验证其干扰效果；当把DYRK1A的表达载体及psi-DY分别转染入N2a细胞,发现内源性Rest mRNA均显著降低；将DYRK1A的表达载体及psi-DY与REST表达载体共转,亦发现REST蛋白显著降低,使用蛋白合成抑制剂cycloheximide (CHX)处理1小时或2小时后,共转DYRK1A的表达载体及psi-DY的HEK293细胞内蛋白降解速度加快；将泛素表达载体、REST表达载体和DYRK1A的表达或干扰载体共转入HEK293细胞中,用泛素抗体(Ubi)作为免疫沉淀的抗体,用REST抗体做western检测时发现DYRK1A高或低表达均可以增强REST蛋白的泛素化程度；而将缺少C末端的REST蛋白的突变形式-REST-FS与DYRK1A的表达或干扰载体共转时,却未发现REST蛋白的降低。5. DYRK1A的表达升高与敲除均可以造成REST的转录活性的降低：把DYRK1A的表达载体及psi-DY分别转染入N2a细胞,发现Bdnf mRNA水平升高,BDNF启动子活性增强；从经过单转pDYRK1A, psi-DY,或空载体以及与REST表达载体共转作用处理的N2a细胞中提取核提取物并进行EMSA检测,发现REST蛋白与经过pDYRK1A和psi-DY处理的核提取物结合能力显著降低。结论1.转录因子REST可以激活人类DYRK1A基因的转录。2.与DYRK1A启动子区的-833to-815bp相对应的第一个NRSE位点是REST可以上调DYRK1A基因的原因。3. Dyrk1a和Rest共同表达在正常成年小鼠大脑、神经发育过程以及PC12、C6和N2a细胞系中。4.无论DYRKIA蛋白水平升高或降低,均可以下调转录因子REST的表达。5.无论DYRK1A蛋白水平升高或降低,均可以下调转录因子REST的转录活性。