【摘 要】
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目的:利用精液特异性甲基化位点确证混合斑中精液的存在,同时利用精液特异性甲基化位点联合的SNP位点确证人群的多态性,并可利用这种多态性进行混合斑中精液供者的个体识别。方法:本课题先利用甲基化敏感型限制性内切酶法（MSRE）对基因组进行酶切,然后利用复合扩增技术（multiplex PCR）和单碱基延伸技术（SBE）对精液、唾液、血液、阴道分泌物特异性的甲基化位点和精液甲基化位点联合的SNP进行检测
【基金项目】
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组织特异性甲基化及其连锁SNP在混合斑鉴定中的应用研究（编号:81701868）,国家自然科学基金,2018年01月-2020年12月,研究经费（20万）； 国家自然科学基金[No.82030058]； 山西医科大学博士基金[BS03201621]； 山西省重点研究与开发（R&D）项目
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目的:利用精液特异性甲基化位点确证混合斑中精液的存在,同时利用精液特异性甲基化位点联合的SNP位点确证人群的多态性,并可利用这种多态性进行混合斑中精液供者的个体识别。方法:本课题先利用甲基化敏感型限制性内切酶法（MSRE）对基因组进行酶切,然后利用复合扩增技术（multiplex PCR）和单碱基延伸技术（SBE）对精液、唾液、血液、阴道分泌物特异性的甲基化位点和精液甲基化位点联合的SNP进行检测。构建了针对精液特异性的12个甲基化-SNP联合标记的复合扩增体系,其中甲基化位点12个,SNP位点16个,另外还有唾液、血液、阴道分泌物甲基化位点各一个,方法如下:（1）组织特异性甲基化位点选自文献,同时利用UCSC数据库的common SNP 151数据集在甲基化位点上下游400bp内寻找SNP位点。（2）对筛选出的甲基化-SNP联合标记利用Primer 3软件设计引物,设计时要求在扩增子序列中只有HhaⅠ、HpaⅡ、HpyCH4Ⅳ、BstUⅠ这四种甲基化敏感型限制性内切酶中的一种酶切位点。（3）对设计好的引物进行引物特异性验证,同时对甲基化位点进行组织特异性验证。（4）将所有引物进行复合扩增,并调整复合扩增体系。（5）利用SNaPshot技术检测组织特异性甲基化位点,并同时检测与精液特异性甲基化位点相邻的16个SNP位点,并得出分型结果。（6）对构建好的体系计算法医学参数。结果:1.成功构建了基于毛细管电泳平台（CE）利用SNaPshot技术检测12个精液特异性甲基化-SNP联合标记的体系,其中包括12个甲基化和16个SNP位点,另外还有检测了唾液、血液、阴道分泌物组织特异性甲基化位点各一个。2.对52个中国北方男性的精液进行了多态性统计,体系的个人识别能力达到0.9998。3.成功检测10 ng以上的精液DNA样本。4.可以成功检测精液与其余体液两两构成的混合斑中含量占50%以上的混合斑,并得到其中精液供者的SNP分型。5.可以成功区分由精液、血液、唾液、阴道分泌物四种体液构成的混合斑中组织的来源并得到精液供者的SNP分型。结论:我们建立了一种检测方法可以检测混合斑中精液、唾液、血液、阴道分泌物的组织来源,并可以同时得到精液供者的SNP分型。
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