论文部分内容阅读
烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt disease)是由茄劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)引起的一种广泛分布于世界热带、亚热带和一些温暖地区严重危害世界烟草生产的毁灭性细菌病害,特别是对连作烟草的危害更为严重,常常对烟草生产造成巨大的经济损失。Ralstonia solanacearum随植株病残体遗落于土壤中成为植物青枯病的主要侵染源,主要从根部侵入,定殖于维管束内。田间的青枯病往往能够在高温高湿条件下迅速爆发成灾,烟株表现整株性枯萎、死亡以及根茎系统的坏死。由于目前缺乏高抗青枯病的品种以及效果显著的药物,对青枯病的防治主要依靠农业防治和综合防治,而且烟草青枯病的一旦发病则很难治理,因此能够快速、准确地检测田间土壤中Ralstonia solanacearum的数量则能够为该病的测报、防治设计、防治效果的评价以及品种抗性评价提供重要的科学依据。传统上烟草青枯病菌的检测方法在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高的缺点,不能很好的满足检测工作的要求。随着分子生物学技术的发展,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)因其具有快速、特异、灵敏的特点已被广泛应用于病原微生物的检测。本研究旨在运用PCR技术,建立土壤中Ralstonia solanacearum的分子检测体系,并初步应用于检测连作烟田土壤青枯菌的越冬基数、烟草生长季节青枯菌的早期侵染情况、不同地块青枯病流行风险分析、不同防治措施的防病效果评价等方面。主要研究结果如下:1.采用常规的细菌学方法分离鉴定了连作烟田土壤中的青枯菌。2.筛选了青枯菌的PCR检测引物,并据此建立了灵敏特异的植物青枯病菌PCR检测体系。研究结果表明,基于青枯菌16SrDNA ITS保守序列的引物对RaITS-1/2,以及基于青枯菌致病性相关基因的特异性引物对Ralflic-F/R,具有灵敏稳定的检测效果。利用优化的青枯菌PCR检测体系,两对引物对的PCR扩增产物大小分别为145bp、724bp,完全符合预期大小。该检测体系特异性强、灵敏度高,检测灵敏度可以达到10 fg DNA/μl,相当于100cfu/mL,适于土壤及其它材料中的Ralstonia solanacearum检测。3.比较了6种提取土壤总DNA的方法,并探索出了一种制备高质量土壤总DNA的方法,有效解决了土壤腐殖酸、腐殖酸样物、酚类化合物、重金属、不明沉淀物、菌体裂解成分和RNA等抑制后续PCR反应的技术性问题。4.构建了土壤青枯菌半定量检测的分子检测体系。对来自田间土壤样品进行了实际检测结果证明了该分子检测体系是稳定可靠的。对来自重庆黔江新华乡的54个田间土壤样品检测结果与田间发病情况基本一致。首次运用该技术还分析评价了连作烟田Ralstonia solanacearum的越冬预警、早期侵染诊断以及农业防治措施的防病效果。