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本文分为以下几个部分进行探讨： 第一部分 早期自发流产患者蜕膜组织中miRNAs基因的差异表达芯片分析及相关靶基因预测 目的: 利用基因芯片筛查技术，筛查早期自发流产和对照组蜕膜组织中差异表达的miRNAs，并通过相关靶基因网站查找相关靶基因，进行生物学分析。 材料和方法: 1.收集本院早期妊娠行清宫术患者的蜕膜组织标本，第一时间放入放有Trizol液的小试管中，-80℃液氮保存。 2.选取早期自发流产病例组、正常人流对照组蜕膜组织标本各3例，送往北京博奥生物有限公司进行miRNA的表达芯片分析。 3.提取各标本总RNA，利用miRNA基因芯片筛选早期自发流产病例组和对照组蜕膜组织中上调或下调1.5倍以上差异miRNA进行聚类分析。 4.通过miRWalk靶基因预测网站（DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、TargetScan）对所获得的有差异表达的miRNAs进行潜在的靶基因预测。 5.DAVID数据软件对差异表达miRNAs中具有血管生成和细胞凋亡功能预测靶基因进行GO-BP、KEGG功能分析。 结果: 1.MiRNAs基因芯片筛查结果显示:早期自发流产子宫蜕膜组织中（差异倍数为1.5）有70条差异表达miRNAs，其中上调差异表达miRNAs有32条，下调差异表达miRNAs有38条。 2.根据差异倍数、在各检测组织中表达量的不同及相关文献，选取上调差异表达miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193a-5p，下调差异表达miR-378a-3p家族(miR-378a-3p、miR-378c、miR-422a)、miR-378a-5p，通过miRWalk网站查找出和血管生成相关的上调miR-125a-5p、miR-29c-3p的共同靶基因VEGFA，和血管生成、细胞侵袭相关的上调miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193a-5p的共同靶基因MMP2;和细胞凋亡相关的3条下调miR-378a-3p家族、miR-378a-5p的共同靶基因Caspase10，进行进一步的GO-BP以及KEGG分析。 3.上调差异表达miR-125a-5p、 miR-29c-3p预测靶基因VEGFA: 1) GO-BP分析结果:具有糖蛋白、负向调控细胞凋亡、信号通路、分泌等生物学功能。 2) KEGG分析结果:通过mTOR信号通路、MAPK信号通路、胰腺癌、神经营养因子信号转导通路、NOD样受体信号通路、癌症路径起调控作用。 4.上调差异表达miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193a-5p预测靶基因MMP2: 1) GO-BP分析结果:集中在脑部和骨骼的发育，细胞外基质调控。 2) KEGG分析结果:膀胱癌、癌症信号通路。 5.下调差异表达miR-378a-3p家族、miR-378a-5p预测靶基因Caspase10: 1) GO-BP分析结果:集中在细胞凋亡的调控。 2) KEGG分析结果:Jak-STAT信号通路、慢性粒细胞白血病、Wnt信号通路、T细胞受体通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢信号通路、Hedgehog信号通路、内噬作用、丙氨酸天门冬氨酸和谷氨酸代谢信号通路。 结论: 1.通过基因芯片检测初步明确了与早期自发流产相关miRNAs的表达谱。 2.早期自发流产脱膜组织中差异表达miRNAs可能通过调控多个靶基因及多个信号通路参与调控早期自发流产的发生。 第二部分 Real-time PCR验证蜕膜组织中差异表达miRNAs，验证相关预测靶基因的表达 目的: 利用Real-time PCR技术，对两组蜕膜组织中差异表达的基因进行验证，以确定基因芯片的准确性;验证miRNA与各自预测的靶基因的靶向作用，同时检测预测靶基因在对照和EPL患者蜕膜组织中的表达。 材料和方法: 1.Real-time PCR方法检测对照和EPL组蜕膜组织中差异表达上调基因miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193 c-5p和下调基因miR-378a-3p、miR-378a-5p、miR-378c、miR-422a的表达。 2.荧光素酶报告基因验证miRNAs及相关靶基因之间的关系。 3.Q-PCR检测对照和EPL组蜕膜组织中相关靶基因的mRNA水平，Westernblotting检测其蛋白水平的表达。 4.Q-PCR检测对照、黄体酮治疗流产组和EPL组蜕膜组织中miR-378a-3p的表达。 结果: 1.Q-PCR结果显示EPL组蜕膜组织中，miR-125a-5p、miR-29c-3p和miR-193c-5p相比正常组表达上调，与基因芯片结果一致。miR-378a-3p、miR-378c、miR-378a-5p在EPL组中表达下调，同时miR-378a-3p的差异更具有统计学意义，而miR-422a的表达没有变化，与芯片结果不相符。 2.荧光素酶报告基因结果证实miR-125a-5p、miR-29c-3p的靶基因是VEGFA。miR-125v5p、miR-29c-3p、miR-193c-5p的共同靶基因为MMP2。miR-378a-3p和miR-378c能够靶向Caspase3。MiR-422a、miR-378a-3p、miRNA-378c和miR-378a-5p均能直接靶向Caspase10。 3.在mRNA水平，预测的靶基因VEGFA在两组中的表达无显著性差异，而预测的靶基因MMP2在EPL蜕膜表达中有显著性增加。此外，预测的靶基因Caspase10、Caspase3在EPL蜕膜表达中有显著性增加(p＜0.05)。在蛋白水平，EPL蜕膜组织中，VEGFA和MMP2比对照组蛋白表达量下降，而Caspase10和Caspase3比对照组表达量增高(p＜0.05)。 4.MiR-378a-3p在黄体酮治疗流产组中的相对表达量较EPL组（未用黄体酮治疗）升高(p＜0.05)。 结论: 1.MiR-29c-3p、miR-125a-5p、miR-193a-5p在早期自发流产患者蜕膜组织中表达上调，可能通过调控靶基因VEGFA和MMP2，影响蜕膜组织的血管生成及滋养细胞侵袭，参与早期自发流产的发生。 2.MiR-378a-3p家族、miR-378a-5p在早期自发流产患者蜕膜组织中表达下调，可能通过调控细胞凋亡靶基因Caspase3和Caspase10的表达上升，导致蜕膜组织细胞凋亡增加，参与早期自发流产的发生。 第三部分 MiR-378a-3p通过靶向Caspase10和Caspase3抑制蜕膜细胞凋亡从而调控早期自发流产 目的: 通过体外蜕膜细胞原代培养，进一步研究miR-378a-3p及靶基因Caspase10和Caspase3在早期自发流产发生中的作用。 材料和方法: 1.无菌状态下采取正常健康妇女人工流产的蜕膜组织，行体外原代细胞培养，进行组织学鉴定。 2.Q-PCR、Western blotting、免疫组化测定病例组和对照组蜕膜组织中靶基因Caspase10和Caspase3的表达。 3.在蜕膜细胞中分别过表达以及干扰miR-378a-3p，检测靶基因的表达以及蜕膜细胞增殖以及凋亡。 4.蜕膜细胞中加入孕激素后，以不同浓度和不同作用时间来检测miR-378a-3p的表达。 结果: 1.蜕膜细胞生长好，经过两次传代到第三代后，镜下形态基本均一，DSC数量达90％以上。 2.免疫组化阳性细胞计数结果显示95％的细胞PRL染色呈阳性，且细胞大小形态均一。染色特点为胞浆内细小棕色颗粒，越近细胞核染色越强。证明本实验所取标本确为蜕膜细胞。 3.MTT实验显示miR-378a-3p能够影响蜕膜细胞的生长。 4.转染miR-378a-3p mimic48小时后，蜕膜细胞凋亡减弱，与对照组相比有显著性差异(p＜0.05)。转染miR-378a-3p inhibitor48小时后，蜕膜细胞凋亡增加，有显著性差异(p＜0.05)。 5.免疫组化实验结果显示EPL蜕膜组织中，凋亡细胞数较对照组明显增加，同时Caspase3的表达比对照组高。 6.相同时间(24hr)内随着孕激素浓度增加，miR-378a-3p表达升高，表达有显著性差异(p＜0.05);孕激素作用时间越长，miR-378a-3p表达上升，有显著性差异(p＜0.05)。 结论: 1.通过体外蜕膜细胞原代培养，进行细胞形态学和PRL检测，建立了体外蜕膜化过程的理想模型，为miRNA的功能研究提供了良好的体外模型。 2.早期自发流产蜕膜组织中miR-378a-3p表达下降，可能通过调控Caspase3和Caspase10的表达增高，促进蜕膜细胞凋亡增加，参与早期自发流产的发生。 3.MiR-378a-3p在蜕膜组织中的表达与功能可能受到孕激素的调控。