溴结构域和额外末端结构域（bromodomain and extraterminal domain,BET）家族蛋白是重要的乙酰化阅读器,家族成员包括含溴结构域蛋白（bromodomain-containing protein,BRD）2、BRD3、BRD4和溴结构域睾丸特异性蛋白（bromodomain testis-specific protein,BRDT）。BET家族成员拥有特殊的双溴结构域,通过识别乙酰化的组蛋白或转录因子,广泛参与调控涉及转录、DNA修复、免疫、代谢、信号转导等的基因表达,成为受到密切关注的抗肿瘤靶点。首个靶向BET的抑制剂JQ1于2010年被报道,截至目前,已经有超过10个BET抑制剂进入临床试验,主要用于肿瘤和心血管疾病的治疗,然而仍没有药物获批上市。BET抑制剂在缺少系统临床前研究资料的情况下,尤其是作用机制的研究仍不完善,便开展了临床试验研究。已经报道的与肿瘤增殖、存活和周期进展相关的多个BET家族靶基因,例如MYC、CDK6和BCL2等的调控不足以完全解释BET抑制剂的抗肿瘤作用机制。BET其它潜在靶基因的阐明是BET家族成员新功能的揭示,也为BET抑制剂的临床治疗和联合应用提供新的可能。另外,限制临床试验进展的主要原因还包括BET抑制剂单药应用疗效普遍较弱,容易产生快速耐药。因此,新型、强效和安全的抑制剂的研发是推动BET抑制剂临床应用的关键。针对以上问题,本论文围绕BET调控机制和新型BET抑制剂抗肿瘤作用及机制研究两个部分展开。为了研究BET调控机制,我们首先利用BET抑制剂处理后的转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）进行候选靶基因的发现研究。结果表明,我们自主研发的新BET抑制剂compound 9能够明显减少吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1）的转录。IDO1是一个免疫检查点蛋白,可以将色氨酸代谢为犬尿氨酸等发挥免疫抑制作用,是最近几年热门研究的抗肿瘤药物靶点。接着,我们对其它BET抑制剂的IDO1抑制作用进行了验证。我们发现,不同的BET抑制剂（JQ1、OTX015和ABBV-075）,对不同组织来源肿瘤细胞系的IDO1蛋白和m RNA水平的表达均有抑制作用,并且这种抑制作用具有时间和浓度依赖性。由于IDO1在不同细胞中的表达水平具有明显差异,因此我们对不表达IDO1的细胞进行γ干扰素（interferonγ,IFN-γ）诱导。结果发现,BET抑制剂也能够明显抑制IFN-γ诱导型IDO1蛋白和m RNA水平的表达。BET主要参与基因的转录调控,因此我们考察了BET家族成员对IDO1是否具有直接调控作用。在SKOV3细胞中,使用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）分别干扰主要BET家族成员BRD2、BRD3和BRD4,发现有效干扰任意一个BET家族成员,都能够在m RNA和蛋白水平明显减少IDO1表达,同时不会影响其它BET家族成员的表达。由于IDO1启动子区域具有明显的组蛋白3第27位赖氨酸乙酰化（histone 3 lysine 27 acetylation,H3K27Ac）富集,利于BET家族蛋白的结合。因此,我们推测IDO1很可能是一个直接的BET家族靶基因。我们通过染色质免疫共沉淀定量PCR（chromatin immunoprecipitation quantitative polymerase chain reaction,Ch IP-q PCR）实验研究发现,BET抑制剂JQ1减少了BRD2、BRD3、BRD4和RNA聚合酶Ⅱ（polymerase II,Pol II）在IDO1启动子区域的富集以及组蛋白3乙酰化（histone 3 acetylation,H3Ac）水平,但不影响其细胞内的总蛋白水平。当加入IFN-γ处理后,BRD2、BRD3、BRD4和PolⅡ在IDO1启动子区域的富集显著增加,JQ1则可以逆转IFN-γ诱导的增加。IDO1通过催化色氨酸转化为犬尿氨酸发挥作用,进一步,我们考察了BET抑制剂对IDO1代谢物犬尿氨酸生成的影响。结果发现,BET抑制剂JQ1和OTX015能够明显减少细胞培养基上清中L-犬尿氨酸的产生,在同等浓度条件下,其减少程度与IDO1抑制剂NLG919基本相当,同时加入BET抑制剂和IDO1抑制剂则可以进一步增强L-犬尿氨酸的生成减少。我们还发现,在相同处理条件下,细胞的增殖生长并没有发生明显改变,因此进一步证明L-犬尿氨酸生成减少与细胞增殖抑制无关。在构建的BALB/c裸鼠移植瘤模型中,BET抑制剂能够显著抑制Ty-82移植瘤的生长,并且可以明显减少移植瘤内的IDO1蛋白和m RNA水平。因此,这些数据表明,BET抑制剂在体外和体内的确能够减少IDO1的表达,也进一步表明了这种减少可以作为一种药效学指标来监测BET抑制剂对IDO1表达肿瘤的抑制作用。为了提高BET抑制剂单药应用的抗肿瘤活性,我们与药物化学课题组合作,对一个Polo样激酶1（Polo-like kinase 1,PLK1）和BRD4双靶点抑制剂BI2536进行改造优化,通过保留BRD4结合基团,去除PLK1结合基团获得了一个新型强效的高度选择性BET抑制剂compound 19。溴结构域选择性结果表明,在筛选的32种蛋白中,Compound 19对BET家族成员BRD2、BRD3、BRD4和BRDT的溴结构域1（bromodomain I,BD1）和溴结构域2（bromodomain II,BD2）均具有很强的结合作用,除了对TAF1（2）有一定抑制作用外,对除BET家族成员外的含溴结构域蛋白均不具有明显结合活性。激酶选择性结果表明,Compound 19不再具有PLK1抑制活性,并且对筛选的24种激酶抑制活性均较弱。体外抗肿瘤活性研究中,我们发现,与目前临床试验研究较多的BET抑制剂OTX015相比,Compound 19的细胞增殖抑制活性更强。在所测试的肿瘤细胞系中,MV4-11对compound 19最为敏感,Compound 19的50%抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC₅₀)明显低于JQ1和OTX015（分别为3.4 n M、49.1 n M和32.3 n M）。一致性地,Compound 19对BET靶基因MYC的抑制作用也更强,10 n M的compound 19和100 n M的OTX015对MYC蛋白和m RNA水平的抑制程度几乎相当。同样的,低浓度（10 n M）的compound 19处理细胞24 h,就可以引起明显的G1期阻滞,作用强于100 n M的OTX015,且具有浓度依赖性。G1期相关的调控蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶6（cyclin-dependent kinase 6,CDK6）的表达水平出现了明显的下降。在凋亡诱导实验中,我们发现compound 19浓度依赖地诱导了MV4-11细胞发生凋亡。在相同浓度条件下,Compound 19的凋亡诱导作用明显强于OTX015,诱导了更多剪切形式的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly（ADP-ribose）polymerase,PARP）的产生,以及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase）家族成员Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8剪切形式的增多。同时,Compound 19对抗凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2,BCL2）的表达抑制作用更明显。与其它BET抑制剂一致,Compound 19也能够减少IDO1蛋白和m RNA的表达并抑制L-犬尿氨酸的生成。体内抗肿瘤活性研究中,我们建立了MV4-11在BALB/c裸鼠的移植瘤模型。Compound 19每天口服给药,连续给药28天,小鼠能够较好的耐受,没有出现死亡。Compound 19能够浓度依赖性地抑制MV4-11移植瘤的生长。50mg/kg的compound 19对移植瘤的增殖抑制比50 mg/kg和100 mg/kg OTX015更强,肿瘤抑制率分别为95.6%、71.5%和87.5%;25 mg/kg的compound 19的抑制作用与100 mg/kg的OTX015基本相当,肿瘤抑制率分别为89.7%和87.5%。此外,我们还对compound 19的药物代谢动力学（pharmacokinetics,PK）特征进行了初步研究。结果显示,compound 19与JQ1不同,其脑内分布较少,可能引起的神经毒性小。不同种属的PK参数研究显示,Compound 19的血浆暴露量随着给药剂量的增加而增多,小鼠的半衰期(T_1/2)相对最短(小鼠,100 mg/kg,T_1/2=4.4 h;大鼠,50 mg/kg,T_1/2=6.3 h;犬,3 mg/kg,T_1/2=6.6 h)。综上,本论文第一部分发现并确证了一个新的BET家族靶基因IDO1,阐明了BET家族调控组成型和IFN-γ诱导型IDO1表达的作用机制。这部分工作提示了BET抑制剂可能通过减少IDO1表达解除IDO1非酶活介导的免疫抑制,促进抗肿瘤免疫作用,也为BET抑制剂与IDO1抑制剂联用提供了理论可能。本研究第二部分对我们自主研发的新型BET抑制剂compound 19的抗肿瘤作用及机制进行了系统研究,为临床前BET抑制剂候选化合物库提供了一个结构新颖、强效、高度选择性,并且具有良好安全性的化合物。