脓毒症（sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应,尤其老年人免疫功能发生变化,对脓毒症的易感性增加,罹患相对危险是年轻者的13.1倍。老龄脓毒症患者可进一步发展为严重脓毒症及脓毒性休克。严重脓毒症病情进展快,预后差,是临床危重患者最主要的死亡原因之一。尽管目前抗生素治疗和外科技术等有了很大地提升,脓毒症病死率仍然很高。已知脓毒症是多种细胞和介质参与的复杂反应。越来越多的研究证明中性粒细胞参与了脓毒症的炎症反应并在其中起协同作用。中性粒细胞是先天免疫系统的最关键效应细胞,在宿主对感染的第一道防线中起到至关重要的作用。中性粒细胞具有广泛的防御感染入侵的功能。之前的研究表明,巨噬细胞和树突状细胞等各类免疫细胞可以分化成不同功能的表型。最近有研究指出,循环中存在相似的不同功能表型的中性粒细胞。他们基于CD16（FcγRIII受体）和CD62L（L-选择蛋白）表达的不同分为不同的中性粒细胞亚群。除成熟中性粒细胞(CD16^high CD62Lhigh)外,还有两个不同的中性粒细胞亚群:未成熟中性粒细胞（CD16low CD62Lhigh）和抑制中性粒细胞(CD16^high CD62^Llow)。未成熟的中性粒细胞可能在成熟中性粒细胞从骨髓中消耗之后出现,并在抗微生物免疫功能中被认为是无效的细胞类型。抑制中性粒细胞被认为能够抑制T细胞增殖,并在减轻严重炎症反应中起重要作用。然而,中性粒细胞如何在感染后迅速到达感染灶中呢?趋化因子在其中发挥着巨大作用。趋化因子是一类相对分子质量为8000¹5000的小分子炎性细胞因子,通过与细胞表面的相关受体结合,在炎性细胞活化和迁移过程中发挥重要作用。SDF-1是由骨髓基质细胞持续分泌的一种炎性趋化因子,也是唯一能与趋化因子受体CXCR4结合并激活的天然趋化因子。SDF-1与CXCR4广泛地表达于多种细胞和组织中,并在细胞的动员、迁移、增殖和存活中起着至关重要的作用。基于体内中性粒细胞活化在炎症环境中的存在,我们通过研究中性粒细胞不同亚群的功能,探讨抑制性中性粒细胞亚群在老龄脓毒症患者免疫抑制中的作用机制,为老龄脓毒症的研究提供新的研究靶点。本课题拟采用临床老年脓毒症患者血液样本和老龄脓毒症小鼠各个组织器官样本阐述不同中性粒细胞亚群的不同分化功能,研究CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群和CXCR4与脓毒症患者预后的相关性,以及CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群通过CXCR4在老龄脓毒症患者免疫抑制中对Treg细胞调控的机制。最后从中性粒细胞亚群的稳态、释放以及回巢各个角度探讨调控CD11bhigh CD62^Llow Ly6Clow CXCR4high中性粒细胞对22月龄的老龄脓毒症小鼠各个器官的保护作用,为临床诊断、治疗脓毒症提供新的靶点和思路。实验方法第一部分l.通过梯度离心法分选老年健康志愿者外周血中性粒细胞,并通过免疫荧光和流式细胞术对其进行鉴定。2.LPS刺激脓毒症患者和老年健康志愿者外周血中性粒细胞后,通过流式细胞术检测中性粒细胞表型的变化规律。3.分析老年脓毒症患者外周血CD15⁺CD16⁺亚群比例分配。4.分析老年脓毒症患者外周血中性粒细胞各亚群中CD11b和CD64的表达情况。5.CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群和CXCR4与老年脓毒症患者预后相关性。第二部分l.通过流式细胞分选方法,分选出老年脓毒症患者CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群,以不同比例与健康老年志愿者外周血单个核细胞共培养,分析其对不同T淋巴细胞增殖的抑制效应。2.通过ELISA法检测IFN-γ和IL-6细胞因子表达水平。3.老年脓毒症患者CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群与健康老年志愿者外周血单个核细胞共培养后,用流式细胞术方法分析其对不同亚群Treg细胞的调控作用。4.通过流式细胞术方法分析不同抑制剂处理后CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群对T淋巴细胞增殖的抑制效应。第三部分1.通过流式细胞术方法分析老龄脓毒症小鼠外周血中性粒细胞亚群的功能以及Gr-1⁺Ly6Clow CD11bhigh CD62^Llow随着老龄重症脓毒症小鼠病情变化的表达情况。2.通过流式细胞术方法检测老龄小鼠在建立脓毒症模型前后血、骨髓、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏中抑制性中性粒细胞亚群含量的变化。3.通过流式细胞术方法分析阻断CXCR4后,老龄脓毒症小鼠血、骨髓、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏中抑制性中性粒细胞亚群与未处理组比较的差异。4.探讨阻断CXCR4和氧化应激后对老龄重症脓毒症小鼠7天生存率的影响。结果第一部分1.老年脓毒症患者早期外周血抑制性中性粒细胞亚群CD16^highCD62^Llow和未成熟中性粒细胞亚群CD16low CD62Lhigh比例明显高于老年健康志愿者,差异有统计学意义（p<0.05）。而CD16^high CD62Lhigh和CD16low CD62^Llow表达组间无显著差异。2.LPS刺激老年健康志愿者中性粒细胞,CD16^high CD62^Llow和CD16low CD62Lhigh比例比未刺激组显著升高,差异有统计学意义（p<0.05）。而CD16^high CD62Lhigh表达无组间显著差异。3.分析老年脓毒症患者外周血CD16⁺亚群比例,CD16hig h CD62Lhigh亚群占CD16⁺亚群比例最少;CD16^high CD62^Llow亚群,CD16low CD62^Llow亚群、CD16low CD62Lneg亚群和CD16^high CD62Lneg亚群占CD16⁺亚群比例较高,其中CD62Lneg所占比列最高,组内差异有统计学意义（p<0.05）。4.老年脓毒症患者全血中性粒细胞CD16⁺亚群中CD11b和CD64的表达情况显示:CD16^high CD62^Llow亚群CD11b和CD64表达比例最高。5.CD16low CD62Lhigh亚群和CD16^high CD62^Llow亚群与APACHEⅡ评分成正相关,差异有统计学意义（p<0.05）。。6.老年脓毒症死亡组APACHEⅡ评分,血乳酸值和CD16^high CD62^Llow CXCR4high亚群的比例均高于老年脓毒症存活组,脓毒症休克组APACHEⅡ评分和血乳酸值均高于脓毒症组,差异有统计学意义（p<0.05）。CD16^high CD62^Llow CXCR4high亚群表达与死亡率成正相关,差异有统计学意义（p<0.05）。第二部分1.将老年脓毒症患者不同比例的CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群与健康老年志愿者外周血单个核细胞共培养,均产生剂量依赖性的抑制T淋巴细胞增殖的效应,差异有统计学意义（p<0.05）。2.以2:1比例混合培养CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群与健康老年志愿者外周血单个核细胞后,IFN-γ和IL-6表达水平低于对照组,差异有统计学意义（p<0.05）。3.以2:1比例混合培养CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群与健康老龄志愿者外周血单个核细胞后,Treg细胞的表达增加,效应Treg细胞亚群表达增加和幼稚Treg亚群表达增加,差异有统计学意义（p<0.05）。4.CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群通过CXCR4和氧化应激介导对T淋巴细胞调控效应。第三部分1.随着老龄脓毒症小鼠病程的延长,Gr-1⁺Ly6Clow CD11bhigh CD62^Llow与Gr-1⁺Ly6Chigh CD11blow CD62Lhigh比例逐渐增加。随着老龄脓毒症小鼠病情不断严重,CD11bhigh CD62^Llow Ly6Clow CXCR4high表达逐渐增强,差异有统计学意义（p<0.05）。2.与健康老龄小鼠相比,内毒素血症引起小鼠血液、肝脏、肺和肾脏中积累的抑制性嗜中性粒细胞CD11bhigh CD62^Llow Ly6Clow数量显着升高,反而骨髓中抑制性嗜中性粒细胞CD11bhigh CD62^Llow Ly6Clow数量明显减少,差异有统计学意义（p<0.05）。当阻断CXCR4信号后,与内毒素血症小鼠相比,阻断后引起小鼠血液、肝脏、肺和肾脏中积累的抑制性嗜中性粒细胞CD11bhigh CD62^Llow Ly6Clow数量显着降低,而骨髓中抑制性嗜中性粒细胞CD11bhigh CD62^Llow Ly6Clow数量明显增加,差异有统计学差异（p<0.05）。3.阻断CXCR4和氧化应激信号后可以明显提高重度脓毒症小鼠7天内的生存率。结论1.老年脓毒症患者外周血中性粒细胞亚群CD16^high CD62^Llow CXCR4high与脓毒症患者病情严重性和死亡率呈正相关。2.CD16^high CD62^Llow中性粒细胞亚群在老年脓毒症患者中通过CXCR4使其效应性和幼稚型Treg细胞亚群功能增强。3.阻断CXCR4信号介导老龄脓毒症小鼠抑制性中性粒细胞亚群归巢效应,同时提高老龄重症脓毒症小鼠生存率。