一、214例婴儿胆汁淤积性肝病患儿的临床分析[目 的]探讨婴儿胆汁淤积性肝病(infantile cholestatic hepatopathy,ICH)患儿的临床特点及病因构成,以协助临床早期诊断和治疗。[方 法]收集2007年1月1日至2018年12月31日的12年间所有在昆明医科大学第一附属医院儿科住院治疗、临床诊断为婴儿胆汁淤积性肝病(婴儿肝炎综合征)患儿的基本信息,记录临床资料,分析原发病病因构成。[结 果]12年间昆明医科大学第一附属医院儿科住院部共收治214名诊断为ICH的患儿,其中本省人口占94.4%,少数民族人口占21.5%,该疾病占本院儿科因肝胆系统疾病而住院治疗的病人数的49%,平均住院日龄为72天,中位住院时间为11天。本院婴儿胆汁淤积性肝病病因构成的前三位是原发病因不明的婴儿胆汁淤积性肝病、CMV感染及泌尿道感染。近五年来,遗传代谢性疾病所致婴儿胆汁淤积性肝病的构成比呈上升趋势。214例婴儿胆汁淤积性肝病患儿中,11.7%合并先天畸形,20.1%合并有呼吸道感染。69.6%的患儿为治疗好转出院。[结 论]1.214名ICH患儿的原发病因前5位分别是:原发病因不明的婴儿胆汁淤积性肝病、CMV感染、泌尿道感染、不明原因的遗传代谢性疾病和胆道闭锁。该疾病在多个少数民族人群中均有发病。2.ICH为我院儿科住院病人中因肝胆系统疾病住院治疗的首要病因。3.早期明确原发病因、早期针对性治疗是争取患者家属配合、改善预后的关键,应尽早开始遗传代谢筛查及基因诊断。二、胆汁淤积性肝病婴儿粪便胆汁酸的检测与分析[目 的]检测ICH患儿粪便中初级胆汁酸CA、CDCA、GCDCA以及次级胆汁酸DCA、LCA、UDCA含量变化,比较分析正常儿童与ICH患儿治疗前、治疗后粪便胆汁酸变化特点。[方 法]选取2014年11月至2015年11月在昆明医科大学附属儿童医院消化内科住院治疗、符合纳入标准的ICH患儿30例,收集ICH患儿未治疗前的粪便标本及血肝功能结果,设为ICH治疗前组,经7天的保肝利胆治疗后,再次收集患儿的粪便标本及血肝功能结果,设为ICH治疗后组,并根据前后肝功能指标转归将ICH治疗后组再分为ICH治疗后好转组及ICH治疗后未好转组。收集30名健康婴儿的粪便标本,设为正常组。使用液相色谱-质谱联用技术检测ICH患儿及正常组婴儿粪便中初级胆汁酸CA、CDCA、GCDCA以及次级胆汁酸DCA、LCA、UDCA含量,对结果进行比较分析,电话随访30例ICH患儿的长期预后。[结 果]粪便初级胆汁酸的比较中,CA、CDCA和GCDCA均表现为ICH治疗前组<正常组,ICH治疗后组<正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。粪便次级胆汁酸的比较中,LCA表现为ICH治疗前组<正常组,ICH治疗后组<正常组,差异有统计学意义(P<0.05);UDCA表现为ICH治疗前组<正常组,ICH治疗前组<ICH治疗后组,差异有统计学意义(P<0.05)。将ICH治疗后组再分为ICH治疗后好转组及ICH治疗后未好转组进行比较发现,CA表现为ICH治疗后好转组及ICH治疗后未好转组均<正常组,CDCA和LCA表现为ICH治疗后未好转组<正常组,UDCA表现为ICH治疗前组<ICH治疗后好转组及ICH治疗后未好转组,差异有统计学意义(P<0.05)。电话随访发现,10名经过7天保肝利胆治疗后肝功能未好转的患儿目前肝功能已恢复正常。[结 论]1.ICH患儿粪便初级及次级胆汁酸含量与正常婴儿存在差异,可能为疾病期间胆汁酸排泄至肠道减少和肠道菌群改变所导致。2.短期(7天)治疗不能代表ICH患儿的长期预后。三、胆汁淤积性肝病婴儿粪便短链脂肪酸的检测与分析[目 的]检测ICH患儿粪便中短链脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸及异戊酸含量,比较分析正常儿童与ICH患儿治疗前、治疗后粪便短链脂肪酸变化特点。[方 法]病例入选标准及分组同第二部分。应用气相色谱技术检测ICH患儿与正常婴儿粪便中短链脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸及异戊酸含量,对结果进行比较分析。[结 果]对碳水化合物代谢产物乙酸、丙酸和丁酸比较发现,粪便乙酸、丙酸和丁酸含量在正常组、ICH治疗前组及ICH治疗后组间无差异(P>0.05)。对蛋白质代谢产物异丁酸、异戊酸的比较发现,ICH治疗前组及ICH治疗后组粪便异丁酸含量均低于正常组,ICH治疗前组粪便异戊酸含量低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。将ICH治疗后组再分为ICH治疗后好转组及ICH治疗后未好转组进行比较发现,乙酸、丙酸和丁酸组间比较无差异(P<0.05),粪便异丁酸含量表现为ICH治疗后未好转组<正常组。[结 论]1.ICH患儿肠道内碳水化合物代谢变化不明显,肠道内蛋白质代谢异常较明显,这可能与ICH患儿的肠道菌群特异变化有关。2.粪便异丁酸有可能是反映疾病是否好转的潜在生物标记物。四、胆汁淤积性肝病婴儿肠道菌群的检测与分析[目 的]探讨ICH患儿治疗前后及治疗后好转与未好转者肠道菌群的构成及多样性变化,寻找与ICH发生发展相关的微生物生物标志物,为开发非侵入性的诊断方法提供理论基础。[方 法]病例入选标准及分组标准同第二部分,应用16S rDNA高通量测序技术检测ICH患儿治疗前后及治疗后(包括好转与未好转者)肠道菌群的构成及多样性变化。将成功测序的49例样本设为“全部病例纳入研究组”进行Alpha多样性分析及对比组间差异菌。将治疗前后完全配对的38例样本设为“治疗前后配对研究组”,分析该组肠道菌群的Alpha多样性及Beta多样性,比较分析38例样本对应的粪便胆汁酸及粪便短链脂肪酸差异,再应用随机森林算法和Spearman相关分析来发现与ICH疾病相关以及和胆汁酸代谢相关的OTUs,将上述两部分OTUs的16s rRNA基因代表序列在NCBI中的微生物全基因组数据库中进行比对得到匹配的物种,再在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)中,基于次级胆汁酸的生物合成通路(ko00121)找出表达胆汁酸代谢的关键酶--胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase,BSH)的菌群,以寻找与ICH发生发展相关的候选微生物生物标志物。[结 果]对49例“全部病例纳入研究组”分析发现,正常组、ICH治疗前组、ICH治疗后组三组间Richnnes、Chao及ACE指数均表现为ICH治疗后组<正常组、ICH治疗后组<ICH治疗前组,差异有统计学意义(P<0.05),三组间Shannon及Simpson指数比较差异无统计学意义。比较肠道菌群门水平组间差异发现:ICH治疗前组厚壁菌门(Firmicutes)丰度高于正常组,ICH治疗前组拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度低于正常组,ICH 治疗前组 Candidatus Saccharibacteria丰度高于正常组及ICH治疗后组,ICH治疗后组蓝藻菌门(Cyanobacteria/Chloroplast)丰度高于正常组及ICH治疗前组,差异有统计学意义(P<0.05)。49份粪便样本中,属水平共有66个菌属被检测出,样本中丰度占优势的菌属为 Bacteroide、Escherichia/Shigell、Bifidobacteriu、Streptococcus、Clostridium_sensu_stricto、Veillonella、Lactobacillus、Enterococcus 及 Akkermansia。正常组与ICH治疗前组比较,差异菌属有20个,正常组与ICH治疗后组比较,差异菌属有17个,ICH治疗前组与ICH治疗后组比较,差异菌属有30个,差异有统计学意义(P<0.05)。对38例“治疗前后配对研究组”分析后,db-RDA分析发现CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸能够影响ICH患儿肠道菌群的分布。随机森林算法现,34个OUTs是与ICH的发生发展相关的重要因子;Spearman相关分析发现粪便胆汁酸与多个OTUs存在显著相关性,选择其中最有意义的59个OTUs。将上述两部分OTUs在NCBI的全基因组数据库及KEGG中的次级胆汁酸生物合成途径(ko00121)中进行比对,找到表达BSH的物种。经过上述比对和分析,发现Streptococcus、Parabacteroides、Lactobacillus和Blautia是与ICH发生发展相关的候选微生物生物标志物。[结 论]1.ICH患儿肠道菌群在门水平及属水平上均与正常婴儿存在差异,存在肠道菌群紊乱。肠道菌群与粪便胆汁酸存在显著相关性,提示肠道菌群与肠道胆汁酸代谢存在相互影响。2.粪便Streptococcus、Parabacteroides、Lactobacillus和Blautia可作为与ICH患儿疾病发生发展相关的候选微生物生物标记物,为临床无创诊断标志物的后续研究提供依据。五、胆汁淤积性肝病婴儿肠道菌群和其相关代谢产物及肝功能的相关性研究[目 的]分析ICH患儿肠道菌群与粪便短链脂肪酸的相关性以及肠道菌群与肝功能指标间的相关性,分析宿主-菌群共代谢物粪便胆汁酸与粪便短链脂肪酸之间及它们与ICH患儿肝功能之间的相关性。[方 法]病例入选标准及分组标准同第二、第三及第四部分。应用Spearman相关分析法分析ICH患儿肠道菌群与粪便短链脂肪酸及肝功能指标的相关性、粪便胆汁酸与粪便短链脂肪酸的相关性及它们与肝功能指标的相关性。[结 果]ICH治疗前组粪便中13个菌属与粪便各短链脂肪酸存在相关性,ICH治疗后组粪便中12个菌属与粪便各短链脂肪酸存在相关性;ICH治疗前组中34个菌属与各肝功能指标存在相关性,ICH治疗后组中13个菌属与各肝功能指标存在相关性;ICH治疗前组及ICH治疗后组中多个粪便胆汁酸及粪便短链脂肪酸间存在相关性,其中粪便异丁酸与所有粪便胆汁酸均存在相关性;ICH治疗前组中粪便CA、CDCA及LCA与肝功能指标存在相关性,ICH治疗后组中粪便CA、CDCA及GCDCA与肝功能指标存在相关性;ICH治疗前组中粪便丙酸、丁酸、异丁酸及异戊酸和肝功能指标存在相关性,ICH治疗后组中异丁酸和肝功能指标存在相关性。[结 论]1.ICH患儿的肠道菌群与肝功能指标存在着显著的相关性,支持某些肠道菌群可以作为ICH诊断的微生物生物标志物。2.粪便CA及CDCA含量可以同步反映ICH患儿血TBA等与胆汁淤积相关的肝功能指标的改变。3.粪便异丁酸含量与反映胆汁酸排泄功能的其他指标的联合应用,可能有更好的临床意义及应用前景。