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SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修饰是一种广泛存在于真核细胞的蛋白质翻译后修饰。有报道显示,一些病毒编码的蛋白能够利用SUMO化修饰系统对宿主蛋白的亚细胞定位、稳定性和信号转导等方面进行调节,抑制或逃逸宿主的免疫反应,从而调控病毒的增殖。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的免疫抑制性疾病。PRRSV编码的Nsp1α是一种多功能的非结构蛋白。通过生物学软件预测发现PRRSV Nsp1α具有被SUMO修饰的潜在位点,但Nsp1α是否真正被SUMO修饰尚需实验验证。本研究从SUMO化修饰这一新的角度探讨PRRSV Nsp1α的生物学功能。主要研究内容如下:1.Nsp1α与SUMO化修饰系统相关蛋白PIAS1、UBC9的相互作用分析构建与SUMO化修饰相关的结合酶UBC9和连接酶PIAS1酵母重组质粒,经检测证实重组质粒pGADT7-PIAS1、pGBKT7-UBC9无酵母毒性及自激活性。利用酵母双杂交技术分析Nsp1α是否与PIAS1、UBC9存在相互作用。结果显示,在酵母系统中,Nsp1α与PIAS1发生相互作用,但与UBC9不存在相互作用。为了进一步验证Nsp1α是否能与PIAS1在哺乳动物细胞中发生相互作用,在HEK-293T细胞中共转染Nsp1α和PIAS1的真核表达质粒,免疫共沉淀实验的结果表明,Nsp1α与PIAS1不存在直接的相互作用。2.Nsp1αSUMO化修饰的检测虽然免疫共沉淀实验证实Nsp1α与PIAS1不存在直接的相互作用,但考虑到生物信息学预测的结果,我们还是进一步分析了Nsp1α是否被SUMO化修饰。在HEK293T细胞中共转染pCAGGS-HA-Nsp1α、pCAGGS-Myc-SUMO1和pcDNA-His-UBC9三种真核表达质粒,通过免疫共沉淀检测Nsp1α是否存在SUMO化修饰。结果发现Nsp1α没有被SUMO化修饰。3.Nsp1α阻碍细胞内SUMO化修饰水平既然Nsp1α不存在SUMO化修饰,那么Nsp1α是否调控宿主蛋白的SUMO化修饰水平呢?为了探讨这一问题,将不同剂量的Nsp1α真核表达质粒和SUMO1真核表达质粒共转染HEK293T细胞,通过Western Blot分析细胞的SUMO修饰水平。结果显示:细胞内的SUMO化修饰水平受到显著的抑制,且与Nsp1α的表达呈剂量依赖性,表明Nsp1α具有去SUMO的特性。根据Nsp1α晶体结构和实验室已有的Nsp1α截短突变体,进一步探讨了Nsp1α阻碍细胞内SUMO化修饰的功能结构域,结果表明,Nsp1α的锌指基序ZF1结构域在这一过程中起着关键作用。4.Nsp1α通过阻碍IRF3的SUMO化修饰,促进IRF3的降解以前的研究证实PRRSV Nsp1α能够拮抗RIG-I介导的β-干扰素(IFN-β)产生。为了探讨Nsp1α去SUMO修饰是否在其拮抗IFN中发挥作用,将Nsp1α真核表达质粒与编码RIG-I通路中关键信号分子(RIG-I、IPS-1、TBK1、IRF3)的表达质粒共转染HEK293T细胞,采用双荧光素酶报告系统进行检测,结果显示:Nsp1α抑制IFN-β的作用靶点为转录因子IRF3;超表达Nsp1α后,IRF3的SUMO化修饰水平显著降低,而且IRF3的稳定性减弱。这说明,Nsp1α能够通过阻碍IRF3的SUMO化修饰,促进IRF3的降解,从而抑制IFN-β的产生。5.Nsp1α赖氨酸位点的分析赖氨酸(K)残基在许多蛋白的翻译后修饰中发挥重要作用。为了分析Nsp1α的赖氨酸残基对其去SUMO化修饰功能的影响,进一步构建了Nsp1α的突变体K117A、K150A、K169A,在HEK293T细胞中过表达这些突变体。Western Blot结果表明,Nsp1α的三个赖氨酸位点均负调控其阻碍细胞SUMO化修饰。双荧光素酶报告系统结果也进一步表明,Nsp1α的赖氨酸位点对其抑制IFN-β启动子具有负调控的作用,且能抑制组成性激活体IRF3-5D诱导的IFN-β启动子的激活。综上所述,本研究证实Nsp1α不能被SUMO修饰,却意外发现Nsp1α能够阻碍细胞内蛋白的SUMO化修饰。更有意义的是,Nsp1α通过阻碍干扰素信号通路中的关键转录因子IRF3的SUMO化修饰并促进其降解,从而拮抗I型干扰素产生,揭示了PRRSV Nsp1α调控干扰素的一种新的作用机制。