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灰树花是一种珍稀的食药两用真菌,其多糖具有辅助抗肿瘤治疗、增强人体免疫功能等作用,在液体培养过程中可将无机硒转化为对人体有益的有机硒。米糠、麸皮是稻谷、小麦加工过程中的副产品,其营养价值高、产量大且价格低廉,有更广阔的开发利用空间。本研究通过诱变筛选出了能在米糠、麸皮培养基上快速生长和高产多糖的优良菌株,探索其较优发酵培养基的组成及活性多糖的提取方法,并研究了灰树花出发菌株富集硒的能力,为采用新的方法完成科研项目制备多糖和多糖有机硒复合保健品的任务奠定了基础。
本研究主要内容如下:
(1)经微波诱变、紫外诱变、原生质体激光诱变和原生质体微波-紫外复合诱变,筛选出菌丝生长速度较快、菌丝多糖产量较高且比较稳定的灰树花变异菌株JSU10-1和JSU10-2。通过电泳图谱分析,推断其与出发菌株Grifola sp.CGMCC4179相比发生了遗传上的变化。
(2)通过培养基均匀试验的探索,采用SPSS回归分析得到出发菌株Grifolasp.CGMCC4179菌丝干重Y1-0(g／100mL)、变异菌株JSU10-1菌丝干重Y1-1(g／100mL)、变异菌株JSU10-2菌丝干重Y1-2(g／100mL)与米糠x1(g／100mL)、麸皮x2(g／100mL)、磷酸二氢钾x3(g／100mL)、硫酸镁x4(g／100mL)、维生素B1 x5(mg／100mL)的回归方程分别为:
Y1-0=0.031x1+0.033x2-0.002x3-0.039x4-0.003x3+0.053
Y1-1=0.035x1+0.036x2-0.267x3-0.077x4+0.013x5+0.094
Y1-2=0.039x1+0.048x2-0.200 x3+0.479 x4+0.018x5+0.030得到Grifola sp.CGMCC4179菌丝多糖Y2-0(mg／100mL)、JSU10-1菌丝多糖Y2-1(mg／100mL)、JSU10-2菌丝多糖Y2-2(mg／100mL)与米糠x1(g／100mL)、麸皮x2(g／100mL)、磷酸二氢钾x3(g／100mL)、硫酸镁x4(g／100mL)、维生素B1x5(mg／100mL)的回归方程分别为:
Y2-0=4.118x1+4.137 x2+17.019x3-3.301x4-0.991x5-3.993
Y2-1=2.660x1+3.962 x2-52.626 x3-66.141x4+8.413x5+27.176
Y2-2=4.298x1+7.899 x2-20.019 x3+80.371x4+0.363 x5-20.617经回归分析,推测出发菌株Grifola sp.CGMCC4179最优培养基成分为:米糠12 g／100mL,麸皮12 g／100 mL,磷酸二氢钾0.35 g／100 mL,硫酸镁0.01 g／100 mL,维生素B10.2 mg／100 mL:变异菌株JSU10-1最优培养基成分为:米糠12 g／100 mL,麸皮12g／100 mL,磷酸二氢钾0.02 g／100 mL,硫酸镁0.01 g／100 mL,维生素B11.8 mg／100 mL；变异菌株JSU10-2最优培养基成分为:米糠12 g／100 mL,麸皮12 g／100 mL,磷酸二氢钾0.02 g／100 mL,硫酸镁0.17 g／100 mL,维生素B11.8 mg／100 mL。
(3)通过米糠、麸皮纤维素酶酶解单因素试验探索,确定酶添加量为50FPU／(g米糠)和45FPU／(g麸皮),酶解时间分别为米糠10h、麸皮10.5h；酶解料液比分别为米糠1:20、麸皮1:30。
(4)通过灰树花菌株在液体发酵培养基B上发酵菌丝干重变化试验的探索,确定变异菌株JSU10-1最大菌丝干重为1.019g／100mL,最大菌丝多糖量为156.7mg／100mL,比同条件下Grifola sp.CGMCC4179分别提高21.3％和21.8％,其中发酵培养基B1组成为:米糠2 g／100ml(50℃酶解后取汁),麸皮12 g／100ml(50℃酶解后取汁),磷酸二氢钾0.11 g／100ml,硫酸镁0.09 g／100ml,维生素B11.4 mg／100ml。JSU10-2最大菌丝干重为0.935g／100mL,最大菌丝多糖量为166.5mg／100mL,比同条件下Grifola sp.CGMCC4179分别提高15.4％和41.8％,其中发酵培养基B2组成为:米糠8g／100ml(50℃酶解后取汁),麸皮9 g／100ml(50℃酶解后取汁),磷酸二氢钾0.08 g／100ml,硫酸镁0.23 g／100ml,维生素B10.8 mg／100ml。
(5)通过灰树花菌丝多糖超声提取均匀试验探索,推测出发菌株Grifola sp.CGMCC4179和变异菌株JSU10-2最优超声条件为:超声料液比1:120、超声功率200W、超声时间23min、超声发出时间6s、超声间隙时间6s,此时,其菌丝多糖得率达到最大,分别为15.5％和15.3％；变异菌株JSU10-1最优超声条件为:超声料液比1:20、超声功率200W、超声时间23min、超声发出时间1s、超声间隙时间6s,此时其菌丝多糖得率达到最大,为10.3％。对不同灰树花菌丝及不同提取方法所得菌丝多糖清除DPPH·能力探索,确定超声辅助低温低压提取(70℃,0.07MPa,2h+2h)所得菌丝多糖对DPPH·的清除率相对较高,效果相对较好。
(6)通过对Grifola sp.CGMCC4179液态发酵富硒的探索,当硒添加量为10mg／L时,富硒菌丝干重为1.256g／100mL,其富硒率为46.3％；富硒菌丝多糖为114.4mg／100mL,其富硒率为2.2％。将该富硒菌丝多糖制备成300meg粒的富硒灰树花粗多糖保健胶囊,每粒胶囊含硒71.9μg,与成年人体硒的需求量76μg／d接近,即正常成年人每日服一粒该富硒多糖保健胶囊便可达到硒的摄入标准。这一结果对制备灰树花富硒保健食品或药品有一定的参考价值。其中发酵培养基组成:米糠10g／100ml,麸皮11 g／100ml,磷酸二氢钾0.15 g／100ml,硫酸镁0.075 g／100ml,维生素B11.0 mg／100ml,硒1.0 mg／100ml。发酵工艺条件:装样量40％,接种量10％,培养温度28±1℃,搅拌速度150r／min,培养时间5d。