目的:以重组腺病毒为IDO表达载体(Ad-IDO),感染供者骨髓来源的DC,将其过继输注给受者,观察高表达IDO的DC输注对受者皮肤移植后体内T细胞亚群分化的影响。同时在体外进行混合淋巴细胞培养,检测同种反应T细胞亚群的分化特征,为阐明IDO抑制同种反应T细胞分化而保护移植物提供实验依据。方法:以293T细胞为包装细胞,扩增重组的Ad-IDO(E1、E3区缺失;外源基因插入E1区;以CMV为启动子,以SV40polyA为加尾信号)。将扩增的Ad-IDO感染供者骨髓来源的DC,与异基因受者小鼠来源的脾脏na?ve T细胞进行共培养,用流式细胞术检测培养体系中同种反应T细胞亚群(Th1、Th17)的比例;将Ad-IDO转染的供者骨髓来源的DC输注异基因受者小鼠,对受者进行皮肤移植,并在移植后取受者的脾脏、淋巴结细胞进行流式检测,以观察其T细胞亚群的比例变化。结果:一、用293T细胞扩增重组腺病毒,并对其进行鉴定。在293T细胞的连续传代培养过程中,Ad-IDO以及Ad对照稳定转染,细胞表现出明显的病变效应;PCR表明,重组腺病毒在多次复制后仍能稳定整合IDO基因;免疫印迹结果表明,不同代数的Ad-IDO感染293T细胞,均能使其稳定表达IDO蛋白。二、高表达IDO的供者骨髓来源DC对受者T细胞亚群分化的影响1、BMDC的培养,腺病毒感染及IDO的表达诱导培养BALB/c小鼠来源的BMDC,并用Ad-IDO及对照组腺病毒进行感染。经RT-PCR鉴定,感染了Ad-IDO的BMDC有IDO的mRNA表达;经Western Blot鉴定,感染后的BMDC可有效表达IDO蛋白。2、IDO及其代谢产物L-Kyn抑制同种反应Th17与Th1分化将感染了Ad-IDO的BMDC与对照组BMDC(BALB/c小鼠来源)分别与C57BL/6脾脏来源的T细胞进行混合淋巴细胞培养,并通过流式细胞术检测。与BMDC及BMDC(Ad-control)组相比,BMDC(Ad-IDO)组的Th17及Th1明显降低;同时设立了加入L-Kyn(IDO降解色氨酸的代谢产物)的组别,其Th17和Th1的比例也明显降低。3、体内输注供者来源IDO高表达DC显著抑制同种反应性Th1而对Th17无明显影响将BALB/c小鼠来源的BMDC过继输注给C57BL/6小鼠,并进行背部的皮肤移植,于移植后不同时间点取受者的脾脏、引流淋巴结,检测其T细胞亚型(Th17、Th1)的比例。与对照组相比,过继输注了感染Ad-IDO的BMDC组的小鼠其脾脏Th1比例明显降低,而Th17处于极低水平,尚不能评价其在各组间的差异。受者淋巴结的T细胞亚群在不同组别间的差距并不明显。结论:以重组腺病毒为载体感染供者骨髓来源的树突状细胞,使其高表达IDO,可抑制不同品系来源的Th1和Th17的分化。之前的研究已经证实,将其过继输注给受者并进行皮肤移植,可以延长皮肤移植物的存活时间;在本研究中,通过检测受者同种反应性T细胞亚群的变化来进一步探讨了其机制。本研究成果提示,使供者骨髓来源树突状细胞高表达IDO,并过继输注可进一步抑制同种移植物排斥反应,具有潜在的临床应用价值。