胆管癌是肝胆系统第二大常见的原发性恶性肿瘤,源于胆管上皮细胞。具有起病隐匿、易早期浸润和远端转移、预后差等特点。根据解剖结构可将胆管癌分为肝内胆管癌和肝外胆管癌。根治术是胆管癌治疗的唯一有效方法。但因其起病隐匿、进展快、对放化疗不敏感等特点,导致其临床疗效差,五年生存率低于10%。其主要原因是胆管癌发生发展过程中的分子作用机制尚未研究清楚。因此,有必要筛选出新的胆管癌发生发展过程中的核心分子,进一步研究胆管癌发生的分子机制,并以此核心分子为靶点进行靶向治疗,改善胆管癌的预后,以其提高胆管癌患者的远期生存率。外被体蛋白复合物亚基β’（coatmoter protein complex subunitvβ’,COPB2）基因位于3q2.3,编码β’-COP亚基,是外被体蛋白复合物的组成亚基之一。参与了内质网和高尔基体间的膜泡反向转运。已有研究表明,COPB2与ADP-核糖基化因子（ADP-ribosylation factor,ARF）GTP酶激活的蛋白2（GTPase-activating protein 2,GAP2）和含KKXX的目的分子互作,从而完成其正常的生理功能。此外,COPB2也与血小板衍生生长因子（PDGF）的β受体互作,激活细胞生长信号传导并诱导细胞有丝分裂。COPB2表达异常也与肿瘤有关。研究发现COPB2参与了体外细胞生长和间皮瘤细胞的细胞凋亡。此外,COPB2在前列腺癌患者的肿瘤组织中表达异常升高;且前列腺癌细胞株LnCaP、DU-145、PC-3和CWR22RV1中均高表达。COPB2沉默不仅抑制了PC-3的细胞增殖和克隆形成,也促进了细胞凋亡,且细胞周期停滞于S期。然而,该基因在胆管癌中的表达及其功能尚未有相关研究。因此,本课题将首次研究COPB2在胆管癌中表达情况,并探究COPB2对胆管癌细胞增殖、凋亡的影响,探讨其可能的分子机理,为胆管癌寻找新的核心分子、治疗靶点提供理论基础。【目的】1.检测COPB2在胆管癌中的表达,分析其临床意义;2.明确COPB2对胆管癌细胞增殖、凋亡的影响;3.探讨COPB2促进胆管癌细胞增殖的可能分子机制。【方法】1.收集27例胆管癌患者病理标本,其中9例包含肿瘤组织和癌旁组织;临床资料包括年龄、性别、肿瘤大小以及TNM分期、组织病理学分级等;免疫组化检测COPB2在胆管患者癌组织和癌旁组织中的表达;依据免疫组化结果对细胞阳性率和细胞染色强度进行评分,将“阳性率评分”和“染色强度评分”的乘积作为总评分,评价COPB2的表达,具体评判标准:低表达（0¹分）和高表达（≥2分）。免疫组化结果结合临床资料数据,采用Fisher’s确切概率统计方法和Mc Nemar统计方法进行统计,分析COPB2的表达差异,评价COPB2表达的临床意义。2.首先,用荧光定量PCR（qPCR）方法检测COPB2基因在2种胆管癌细胞株RBE和QBC939中的表达含量;其次,依据NCBI公共数据库中所公布的COPB2基因核苷酸序列,合成其特异性干扰片段;以慢病毒GV115作为载体,构建COPB2基因的慢病毒特异性干扰载体（sh COPB2）和其对照干扰载体（shCtrl）,分别转染293T细胞,Western blot和qPCR分别检测COPB2敲减效率;然后,用上述两种干扰载体分别转染RBE和QBC939细胞,利用Celigo法检测2种细胞连续5天的生长情况,分析敲减COPB2基因后对RBE和QBC939细胞生长的影响;利用MTT法检测2种细胞连续5天的活力情况,分析敲减COPB2基因后对RBE和QBC939细胞增殖的影响;分别用碘化丙啶和Annexin V-APC单染色试剂盒染色shCOPB2和shCtrl转染的RBE和QBC939细胞,利用流式细胞术检测凋亡早期的凋亡细胞数量,分析敲减COPB2基因后对RBE和QBC939细胞凋亡的影响;流式细胞术检测RBE和QBC939细胞内DNA的含量,分析处于G₂/M、S和G₀/G₁期细胞的比例,以及敲减COPB2基因后对细胞周期的影响。3.提取shCtrl和shCOPB2转染的RBE细胞总蛋白,用PathScan?RTK Signaling Antibody Array Kit进行反应;提取芯片数据,比较shCtrl组和shCOPB2组数据,筛选差异分子。【结果】1.分析COPB2在胆管患者癌组织和癌旁组织上皮细胞的表达检测结果表明:COPB2在癌旁细胞的胞浆中呈低表达,而在癌细胞的胞浆中则主要呈高表达;COPB2在癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P=0.008）。癌组织中COPB2在胞浆中的表达与肿瘤大小、TNM分期、病理分级有关（P均<0.05）,而与患者性别、年龄无关（P均>0.05）。病理结果证实COPB2蛋白在癌组织中表达升高,且随着肿瘤的进展和病理分级的增加进一步的升高。2.qPCR结果表明,COPB2在胆管癌细胞RBE和QBC939中均高表达;PCR和测序结果表明,成功构建了COPB2特异性干扰的GV115载体;shCOPB2和shCtrl转染293T细胞后,利用荧光显微镜对细胞生长情况的检测发现,上述干扰载体的转染对293T细胞的正常生长无影响。Western blot检测结果表明,shCOPB2转染的RBE和QBC939细胞的COPB2蛋白表达显著低于shCtrl组（P<0.01）。qPCR检测结果证实,shCOPB2组中COPB2 mRNA的表达相对于shCtrl组显著下降（P<0.01）。Celigo法检测结果表明,shCOPB2组RBE和QBC939细胞增殖与shCtrl组相比明显被抑制（P<0.01）,尤其在第4天和第5天;以上结果表明,敲减COPB2基因表达能够抑制了胆管癌细胞的增殖。流式细胞术检测结果表明,相对于shCtrl组相比,shCOPB2组的RBE和QBC939细胞中G₀/G₁期的细胞百分比明显升高（P<0.01）,而S期的细胞百分比则明显下降（P<0.01）,而G₂/M期的细胞百分比则在RBE细胞中无变化（P>0.05）,而在QBC939细胞中则明显升高（P<0.01）;上述结果表明,敲减COPB2基因将导致胆管癌细胞的细胞生长周期停滞于G₀/G₁期。流式细胞术检测RBE和QBC939细胞凋亡早期结果表明,shCOPB2组的早期凋亡细胞百分比与shCtrl组相比均显著增加（P均<0.01）。MTT法检测结果显示,shCOPB2组与shCtrl组相比,细胞活力在第4天和第5天显著下降（P均<0.01）,表明敲减COPB2基因将导致胆管癌细胞的增殖明显下降。3.抗体芯片数据分析结果表明,以shCtrl组相比,shCOPB2组差异表达的RTK信号分子共有13个,其中7个磷酸化水平上调,其中上调最显著的为ERK1/2分子,上调了约39.4%;6个磷酸化水平下调,其中下调最明显的为Src,下调了约为25.5%。上述结果说明,COPB2敲减后可能主要通过激活ERK1/2并抑制Src分子抑制了胆管癌细胞的增殖。【结论】1.胆管癌患者癌组织中COPB2的表达明显高于癌旁组织。临床资料的相关性分析表明,COPB2表达的高低与肿瘤大小、TNM分期以及病理分级有关,可能是胆管癌预后的危险性指标。2.敲减COPB2基因显著抑制了胆管癌细胞的增殖,促进了其凋亡,导致胆管癌细胞生长周期停滞于G₀/G₁期。3.COPB2敲减抑制胆管癌细胞增殖,可能通过激活ERK1/2并抑制Src途径而实现的。