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第一部分抗霉素A与环孢素A对大鼠海马神经元活性的影响
目的：用细胞色素C(CytochromeC，Cyt-C)激动剂抗霉素A(AntimycinA，AA)和Cyt-C抑制剂环孢素A(CyclosporineA，CsA)，干预体外培养的海马神经元，探讨抗霉素A与环孢素A对大鼠海马神经元活性的影响及其发挥作用的最佳浓度。
方法：用无血清培养法体外培养大鼠海马神经元。取培养8d的海马神经元，抗霉素A实验随机分为6组：正常对照组：不做任何特殊处理，正常培养；抗霉素A组终浓度分别为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L。环孢素A实验随机分为6组：正常对照组；环孢素A组终浓度分别为0.02μg/ml、0.2μg/ml、2μg/ml、20μg/ml、200μg/ml。各组37℃孵育4h。用酶联免疫监测仪于波长490nm处读取OD值，检测细胞活性。
结果：抗霉素A实验：与正常对照组比较，抗霉素A10μmol/L，组神经元活性无明显变化，随着浓度升高，其它浓度的抗霉素A组海马神经细胞的活性均明显下降(P<0.05)，浓度为20μmol/L，时细胞活性降低明显；环孢素A实验：与正常对照组比较，环孢素A浓度为0.02μg/ml、0.2μg/ml两组海马神经元的活性无明显差异，2μg/ml以上浓度使海马神经元的活性明显降低(P<0.05)，0.2μg/ml为实验最佳浓度。
小结：Cyt-C激动剂抗霉素A可降低大鼠海马神经元的活性，20μmol/L为最佳浓度；低浓度Cyt-C抑制剂环孢素A对大鼠海马神经元的活性无明显影响，0.2μg/ml为实验最佳浓度。
第二部分Cyt-C对黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达影响
目的：通过使用Cyt-C激动剂和抑制剂，探讨Cyt-C的变化对黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(Cysteinylaspartatespecificprotease3，caspase-3)表达影响，从而确定黄芪注射液的抗凋亡作用是否通过抑制Cyt-C来实现。
方法：取原代培养8d的大鼠海马神经元，抗霉素A组随机分为6组：正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液溶剂对照组、抗霉素A组、抗霉素A+黄芪注射液组、黄芪注射液组；环孢素A组随机分为6组：正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液溶剂对照组、环孢素A组、环孢素A+黄芪注射液组、黄芪注射液组。
除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5h再复氧复糖，各组于复氧复糖后6h采用免疫组织化学染色法和蛋白免疫印迹(westernblotting)法检测海马神经元caspase－3蛋白的表达，并采用反转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)方法检测海马神经元Caspase-3mRNA的表达。
结果：免疫组织化学结果：抗霉素A对大鼠海马caspase-3阳性神经元形态和数目的影响：正常对照组大鼠海马神经元细胞核规整，细胞突触明显，有少许细胞胞浆黄染；模型组大鼠海马神经元细胞核皱缩、突触回缩，大量海马神经元胞浆黄染，胞核内有少量黄色颗粒；黄芪注射液溶剂对照组海马神经元亦可见到明显的核皱缩、突起回缩和胞浆黄染与模型组相似；黄芪注射液组大鼠海马神经元有轻微核皱缩，可见部分神经元胞浆黄染；抗霉素A组大鼠海马神经元细胞核皱缩较模型组更加明显，绝大部分神经元细胞胞浆黄染；抗霉素A+黄芪注射液组较之抗霉素A组神经元细胞核皱缩、突触回缩程度略有减少。与正常对照组相比，模型组大鼠海马神经元Caspase-3蛋白阳性表达明显增多(p<0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组大鼠海马神经元Caspase-3蛋白阳性表达显著减少(p<0.05)；黄芪注射液溶剂对照组无明显变化；抗霉素A组Caspase-3蛋白阳性表达显著增多(p<0.05)；抗霉素A+黄芪注射液组Caspase-3蛋白阳性表达与抗霉素A组相比明显减少(p<0.05)。环孢素A对大鼠海马caspase-3阳性神经元形态和数目的影响：正常对照组、模型组、黄芪注射液溶剂、黄芪注射液组大鼠海马神经元形态学与Caspase-3蛋白阳性表达同抗霉素A实验组；环孢素A组大鼠海马神经元部分细胞核皱缩，胞浆黄染；环孢素A+黄芪注射液组较之环孢素A组神经元细胞核皱缩、突触回缩程度显著减少。与模型组相比，环孢素A组大鼠海马神经元Caspase-3蛋白阳性表达较之减少(p<0.05)；环孢素A+黄芪注射液组Caspase-3蛋白阳性表达与环孢素A组相比显著减少(p<0.05)。
Westernblotting结果显示：抗霉素A对大鼠海马神经元caspase-3蛋白表达的影响：与正常对照组相比，模型组海马神经元caspase-3蛋白表达的平均灰度值明显增加(P<0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05)，黄芪注射液溶剂对照组无明显变化，而抗霉素A组caspase-3蛋白的平均灰度值略有增加(P<0.05)；与抗霉素A组相比，抗霉素A+黄芪注射液组caspase-3蛋白的平均灰度值略有降低(P<0.05)。环孢素A对大鼠海马神经元caspase-3蛋白表达的影响：正常对照组、模型组、黄芪注射液溶剂、黄芪注射液组大鼠海马神经元caspase-3蛋白表达趋势同抗霉素A实验组。与模型组相比，环孢素A组caspase－3蛋白的平均灰度值降低(P<0.05)；与环孢素A组相比，环孢素A+黄芪注射液组caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05)。
RT-PCR结果显示：抗霉素A对大鼠海马神经元caspase-3mRNA表达的影响：与正常对照组相比，模型组海马神经元caspase-3mRNA的平均光密度值均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组caspase-3mRNA的平均光密度值明显降低(P<0.05)，黄芪注射液溶剂对照组无明显变化，抗霉素A组caspase-3mRNA的平均光密度值略有增加(P<0.05)；与抗霉素A组相比，抗霉素A+黄芪注射液组caspase-3mRNA的平均光密度值略有降低(P<0.05)。环孢素A对大鼠海马神经元caspase-3mRNA表达的影响：正常对照组、模型组、黄芪注射液溶剂、黄芪注射液组大鼠海马神经元caspase-3mRNA表达同抗霉素A实验组。与模型组相比，环孢素A组caspase-3mRNA的平均光密度值降低(P<0.05)；环孢素A+黄芪注射液组比较环孢素A组caspase-3mRNA的平均光密度值明显降低(P<0.05)。
小结：1.抗霉素A可显著增多缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Caspase-3蛋白阳性和caspase-3mRNA的表达。
2.抗霉素A可对抗黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达作用。
3.环孢素A可显著降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Caspase-3蛋白阳性和caspase-3mRNA的表达。
4.环孢素A可促进黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达作用。
结论：1.缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元胞浆中Cyt-C的变化与凋亡相关基因caspase-3的表达相一致，说明Cyt-C在缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡中起促进作用。
2.黄芪注射液可通过抑制线粒体释放Cyt-C，减少caspase-3的表达，从而发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的抑制作用。