羧酸酯酶E4、细胞色素P450CYP9G2和羧酸酯酶B1突变基因的重组酶对农药的生物降解

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本研究从抗有机磷杀虫剂的桃蚜Myzuspersicae成虫细胞的匀浆中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出羧酸酯酶E4(CbEE4)的编码基因,序列分析结果表明该基因开放阅读框由1659个核苷酸组成,推测产生的编码产物由552个氨基酸组成,N端23个氨基酸为信号肽,同时克隆了不含信号肽的CbEE4编码基因。桃蚜CbEE4基因与库蚊Culexpipiens羧酸酯酶B1基因核苷酸序列的同源性为54%,翻译后的蛋白质的氨基酸序列同源性为35%。将CbEE4基因亚克隆到表达载体pET28b,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),体外诱导表达,含信号肽的E4基因不能在大肠杆菌中表达,无信号肽的E4基因能高效表达产生融合蛋白,该蛋白能迅速降解羧酸酯酶特异性底物a-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯。本研究发现重组CbEE4对拟除虫菊酯和氨基甲酸酯两类农药有选择性降解,并有着良好的水解活性。胺菊酯、联苯菊酯、苄氯菊酯、西维因、仲丁威、克百威和残杀威有良好的降解效果,其中,在2.5hr内能够降解64%的西维因,在1.5hr内能够降解66%的胺菊酯,在3hr内能够降解69%和71%的联苯菊酯和苄氯菊酯,在2.5hr内能够降解80%的马拉硫磷。但是羧酸酯酶E4对其它的农药(如抗芽威和溴氰菊酯)并没有检测到降解效果,说明CbEE4对农药的水解与底物的结构有很大关系。对CbEE4的作用机理的研究,为从分子水平设计高效解毒酶提供理论依据。 细胞色素P450氧化还原酶(简称P450)是昆虫体内的一种多功能氧化酶,它不仅参与激素、脂肪酸和甾醇类激素等内源化合物的代谢,而且在药物、杀虫剂、植物毒素等外源物的解毒中也起着重要作用。在进行酶解反应时,需要NADPH-细胞色素P450还原酶(简称P450还原酶,POR)作为辅酶。因此,本研究设计了在同一宿主菌中同时表达P450酶和P450还原酶,以得到具有P450生物活性的完整的酶系统。将来源于小菜蛾的CYP9G2基因和来源于家蝇的POR基因亚克隆到双基因表达载体pETDuet,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),诱导表达得到的酶液做细胞色素P450和P450还原酶。本研究为探索细胞色素P450CYP9G2在农药残留降解中的应用奠定了基础。本研究发现诱导表达得到的酶液做细胞色素P450和P450还原酶以13种有机磷农药和6种氨基甲酸酯农药为底物,进行了降解实验,实验结果发现杀螟硫磷,乐果,甲基对硫磷,对硫磷,毒死蜱,马拉硫磷,三唑磷,抗蚜威,灭多威和克百威在两个小时内有明显降解效果,分别可以降解64%的杀螟硫磷、53%的乐果、62%的甲基对硫磷、17%的对硫磷、29%的毒死蜱、19%的马拉硫磷和26%的三唑磷。 通过体外定点突变,成功获得蚊虫羧酸酯酶B1的G110D、W224L和W224S三个单点突变体和G110D-W224L、G110D-W224S两个双点突变体,用pET28a载体在大肠杆菌BL21(DE3)高效表达、纯化后,得到5个突变蛋白。测定B1及其突变体对4种有机磷杀虫剂久效磷、毒虫畏、马拉硫磷、甲基1605的降解,它们分别是二甲氧基、二乙氧基氧化型和还原型有机磷,结果显示B1野生型和两个单点突变体G110D、W224S以及双点突变体G110D-W224S对这四种杀虫剂没有明显的降解,而W224L和G110D-W224L突变体对久效磷、毒虫畏、马拉硫磷的降解效果很显著,他们的降解的动力学参数很相近。
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