背景如何更有效的治疗大段骨缺损历来是骨科工作者挑战的一个难题[1]。采用自体骨移植的方法虽然效果好,但是由于骨量的限制,大多数病人无法实现[2,3]。而应用同种异体骨进行移植,因为有强烈的免疫反应,恢复的往往很差[4]。随着材料学的发展,人工骨移植的使用逐渐增多,而这个方法成骨效果差,临床应用仍未取得好的进展。近几年来,随着组织工程骨的出现,为大段骨缺损的治疗提供了理想的手段[5,6]。然而,虽然相对于一般的人工骨移植,组织工程骨的成骨作用相对较好,但仍未达到期待的水平。近几年来对于提高组织工程骨成骨效果的研究十分火热,主要方向集中在血液的供给与神经的支配两个方面。良好的血供可以给组织工程骨提供氧气与营养,以及一些成骨促成因子,所以血管化有助于骨的生长与再生,这已经得到了业界的广泛认可[7]。但神经支配对于组织工程骨成骨的作用机制却并不是很清楚,它需要我们进一步的研究。有研究发现,感觉神经化可以促进组织工程骨成骨,其成骨效果与血管化相似,而运动神经化却没有效果[8]。这个研究结果表明这两类神经对于组织工程骨的成骨效果是不一样的。本研究则是基于这一研究结果,通过制作大鼠大段骨缺损模型,用小动物验证了感觉神经化能促进大段骨缺损修复这一结论;再通过细胞实验,来探讨分子机制;最后通过对比感觉神经与运动神经的不同,筛选出差异蛋白,为进一步的研究提供新的方向。目的探讨感觉神经化促进大鼠股骨大段骨缺损修复的机制,为大段骨缺损治疗提供新方法。方法第一部分:感觉神经化大鼠大段骨缺损模型的制作与修复效果的观察采用成年SD大鼠作为实验动物,在组织工程骨材料上敷上GFP+的BMSCs作为种子细胞,然后分别制作大段骨缺损空白组、组织工程骨植入组和感觉神经移植组动物模型。分别在1周、4周、8周手术获取大鼠实验肢股骨,拍摄X光片和Micro-CT,观察成骨效果。固定、去除钙盐后切片,行HE和共聚焦染色,显微镜下拍摄图片,探究其组织学变化。第二部分:不同浓度两种神经匀浆对大鼠BMSCs的影响用显微外科手术的方法提取大鼠隐神经与坐骨神经肌支分别作为感觉神经与运动神经组织。按每10 mg神经加入1 mL成骨诱导液,首先制备10 mg/mL的神经匀浆。过滤提纯后10倍稀释,制备出从高到低5种不同浓度梯度的神经匀浆提取液,-80℃冻存备用。体外培养GFP+大鼠幼鼠BMSCs,常规培养至第3代后分别加入以上5种浓度梯度的感觉神经匀浆与、运动神经匀浆作用,14 d后行CCK-8检测与ALP染色,观察BMSCs的增殖与分化情况。第三部分:共培养状态下DRG对BMSCs的影响混合共培养实验:取SD大鼠新生鼠DRG,与GFP+BMSCs混合共培养,观察细胞的生长状态与变化。隔离共培养实验:取SD大鼠新生鼠DRG,消化后按1×103个细胞/Transwell小室的比例,接种感觉神经元细胞,每个Transwell接六个DRG,再将其放入六孔板中,作为实验组;对照组六孔板中只加入BMSCs,放入未添加DRG的Transwell小室。由于细胞自带绿色荧光,可以随时观察细胞的生长变化,10d后进行CCK-8检测,成骨相关抗体染色,拍摄共聚焦图片。第四部分:iTRAQ技术筛选小鼠感觉神经、运动神经的差异蛋白取300只昆明小鼠的坐骨神经肌支作为运动神经,隐神经作为感觉神经,各分为两组,划分成四组,感觉神经组记为Y1、Y2,运动神经组记为Z1、Z2。而后两两比较,找出两种不同神经的差异。结果第一部分:感觉神经移植组的成骨效果优于空白组,新生骨数量增加,并且种子细胞的存活与增殖数量均显著多于对照组。第二部分:CCK-8结果显示:浓度位于0.1~1.0 mg/mL的感觉神经匀浆提取液促进BMSCs增殖的作用最明显(P<0.05);浓度为10 mg/mL的运动神经匀浆提取液对BMSCs增殖的抑制作用明显(P<0.05);ALP染色结果显示:两个匀浆添加组的着色结晶数量都远远少于未添加组(P<0.05)。第三部分:混合共培养实验中BMSCs细胞有向感觉神经元迁移、富集的现象发生;隔离共培养实验中,加入DRG共培养的组BMSCs的量显著高于未添加组(P<0.05)。BMSCs成骨方向变化的能力加DRG组培养组明显小于未加组。第四部分:通过计算机对比测定,得到差异蛋白1667种。结论感觉神经化有促进组织工程骨成骨的效果。其作用原理可能在于感觉神经能够提高BMSCs增殖的能力,并影响其成骨方向转变的能力。而造成这种效果的作用因子因该存在于感觉神经与运动神经的差异蛋白中。我们通过iTRAQ的方法可以成功筛选出感觉神经与运动神经的差异蛋白,从中或许可以找到感觉神经促进成骨发挥作用的作用因子。