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胡桃楸（Juglans mandshurica）为东北地区三大硬阔树种之一,具有很高的经济价值和药用价值。目前林业生产上以实生繁殖为主,但是胡桃楸种子具有深休眠的特性,导致其萌发率低,无法达到生产的需求,因此采用组织培养离体快繁的途径可以在短时间内获得大量生长性状一致的苗木。但是在胡桃楸组织培养过程中,外植体极易发生褐化,导致外植体生理功能衰退,褐化已成为限制胡桃楸离体快繁获得再生植株的一个瓶颈。因此,本研究以胡桃楸带芽茎段为外植体,对其离体培养过程中外植体褐化,从生理学及细胞学角度探讨茎段在褐化前后生理代谢水平酶的动态变化及外植体的细胞形态结构变化。同时,选取不同褐化程度的外植体进行转录组测序,筛选出外植体褐化相关的差异基因,并进行克隆和表达分析。该研究成果为胡桃楸离体快繁和植株再生体系的建立奠定了坚实的基础。主要研究结果如下:1.在对胡桃楸带芽茎段进行离体培养时,0.1%Hg Cl2消毒10 min的效果是最好的,并且在初代培养基中添加Na2S2O3（1.0,2.0,3.0,4.0,5.0）mg/L、2%PVP（1.0,2.0,3.0,4.0,5.0）mg/L、AC（1.0,2.0,3.0,4.0,5.0）mg/L、VC（1.0,2.0,3.0,4.0,5.0）mg/L抗褐化剂后外植体褐化程度显著下降,胡桃楸离体培养过程中加入3 mg/L的AC和5 mg/LNa2S2O3效果最好;通过测定不同培养阶段的茎段体内酶活性,发现褐化的外植体体内多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）、过氧化物酶（peroxidase,POD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性变化幅度均明显大于未褐化外植体,PPO的活性呈现先上升的趋势是因为机械损伤造成底物浓度的增加和与底物接触的机会增多,随着底物逐渐被消耗和产物的增加,PPO活性开始呈现下降的趋势,说明PPO与外植体的褐化有着密切的关系;保护酶POD和SOD呈现先上升后下降的趋势,因为逆境原因造成POD和SOD活性上升,随着培养时间的延长活性氧平衡遭到破坏,抑制了POD和SOD活性,又呈现下降的趋势;MDA一直呈现上升的趋势,说明膜质过氧化增加,酚与酶的区域性分布被破坏,加重了外植体的褐化;徒手切片显示细胞褐化发生后,细胞结构被破坏,细胞中沉积着大量的褐色物质。2.通过对不同褐化程度的胡桃楸茎段进行转录组测序得到16398条平均长度为1439.30bp的非冗余Unigene。通过Blastx将所有的Unigene依次比对到蛋白数据库中,注释到Nr数据库Unigene数量最多（45002条,51.83%）,KEGG数据库注释到的数量最少,（21716条,25.01%）;CKvs M、CKvs T、Tvs M三组分别存在差异表达的基因为18382个、6942个和15452个,CKvs M和Tvs M上调基因远高于下调基因;GO功能分类注释CK和M组,主要有3639个功能,富集到KEGG 124条pathway;CK和T组共得到3723个功能注释,富集到KEGG123条pathway,T与M组共得到3398个功能注释,富集到KEGG 124条pathway,其中苯丙烷的合成和花青素的合成在胡桃楸外植体褐化中起着关键的作用,共得到37个与褐化相关的基因,从差异表达基因中随机筛选出15个（PAL、PAL1、CCR、HCT、POD1、POD4、POD12、、POD42、POD51、CAD1、CAD9、BGLU42、UGT9、UGT1）与褐化相关的关键基因,进行q RT-PCR验证,其表达量与转录组结果变化趋势相似。3.苯丙烷合成途径在胡桃楸组培褐化过程中起着重要的作用,利用转录组数据筛选出苯丙烷合成重要的基因HCT和POD4,成功克隆并分别命名为Jm HCT和Jm POD4,长度分别为873 bp和417 bp,通过系统进化分析与核桃亲缘关系近。胡桃楸不同褐化程度组织中Jm HCT基因在第9 d的表达量较高,当外植体受到机械损伤使底物含量增加,所以Jm HCT基因的表达量先上升,底物酚类物质被不断的消耗,所以后又呈现下降的趋势。Jm POD4基因在第6 d的表达量最高,与酶活性的测定结果相一致,Jm POD4基因前期的升高是因为机械损伤造成的逆境引起的,随着活性氧的积累和产物的积累抑制了Jm POD4基因的活性,所以Jm POD4基因的表达量先上升再下降。综上所述,胡桃楸的外部形态、内部细胞结构、生理生化以及内部基因的表达对褐化胁迫进行了响应。随着褐化程度的加深,外植体外部颜色逐渐由绿色变为黑褐色;内部的酶PPO、POD和SOD呈现先上升后下降的趋势,MDA一直呈现上升的趋势,并且细胞结构遭到破坏。差异基因富集到与褐化相关2条通路中苯丙烷的合成和花青素的合成,共得到37个褐化相关的基因。在培养基中加入抗褐化剂是有效降低褐化的的方法,抗褐化剂可以有效降低PPO的活性,并且可以加大对氧的溶解,从而降低褐化的发生。