【摘 要】
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提高母猪的繁殖性能对我国畜牧业的发展十分重要。卵泡是卵巢的基本功能单位,颗粒细胞是卵泡中最大的细胞群,在卵泡发育、成熟、凋亡和闭锁过程中起重要作用。海藻酸是一种从褐藻中提取的天然多糖,广泛应用于化学工业与食品工业等领域,已有研究证明海藻酸有一定的抗炎、抗过敏、免疫调节等生物活性,但海藻酸对雌性生殖的影响鲜有报道。随着海藻酸越来越广泛地使用,其对家畜生殖发育的影响值得研究。本研究以猪卵巢颗粒细胞为研
【基金项目】
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猪高产优质高效性状形成的调控网络及多基因互作机制项目（编号:2021YFF1000602）
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提高母猪的繁殖性能对我国畜牧业的发展十分重要。卵泡是卵巢的基本功能单位,颗粒细胞是卵泡中最大的细胞群,在卵泡发育、成熟、凋亡和闭锁过程中起重要作用。海藻酸是一种从褐藻中提取的天然多糖,广泛应用于化学工业与食品工业等领域,已有研究证明海藻酸有一定的抗炎、抗过敏、免疫调节等生物活性,但海藻酸对雌性生殖的影响鲜有报道。随着海藻酸越来越广泛地使用,其对家畜生殖发育的影响值得研究。本研究以猪卵巢颗粒细胞为研究对象,旨在探究海藻酸对细胞活力、类固醇激素合成的影响,并从氧化应激、凋亡与自噬等方面探究了其影响机制。本研究首先使用添加海藻酸的DMEM/F12培养液培养猪卵巢颗粒细胞,通过CCK8检测、ROS染色、ELISA、RT-q PCR和蛋白免疫印迹等方法,探究海藻酸对细胞活力及类固醇激素合成的影响;通过GSH荧光染色、GSH定量、ROS染色、TAOC检测、MDA检测、Annexin V/PI凋亡检测、JC-1线粒体染色和自噬泡染色等方法探究海藻酸对细胞氧化应激、凋亡及自噬的影响。最后,本研究以10 mg/Kg的剂量,连续35天向小鼠腹腔注射海藻酸溶液,进行活体验证。本研究得出以下结果:1.20μM及以上浓度的海藻酸显著抑制猪卵巢颗粒细胞活力。CCK8检测、ROS荧光染色和Caspase-3及P62蛋白的免疫印迹结果表明,当海藻酸浓度≥20μM时,其浓度越高,猪卵巢颗粒细胞的活力越低。2.20μM海藻酸抑制猪卵巢颗粒细胞类固醇激素合成。与对照组相比,猪卵巢颗粒细胞经20μM海藻酸处理24 h后,雌二醇（P＜0.01）和孕酮（P＜0.001）的合成量显著下降,细胞中类固醇激素合成关键蛋白CYP19A1（P＜0.05）、FSHr（P＜0.05）和St AR（P＜0.05）表达量显著下降,蛋白CYP17A1的表达量显著增加（P＜0.05）。3.20μM海藻酸促使猪卵巢颗粒细胞发生氧化应激。与对照组相比,猪卵巢颗粒细胞经20μM海藻酸处理24 h后,细胞中GSH水平显著下降（P＜0.01）,ROS水平显著提高（P＜0.05）,TAOC水平显著下降（P＜0.05）,MDA水平显著提高（P＜0.05）,蛋白免疫印迹结果表明抗氧化蛋白SOD1（P＜0.05）、SOD2（P＜0.01）和GPX5（P＜0.05）表达量都显著下降。4.20μM海藻酸促进猪卵巢颗粒细胞线粒体介导的细胞凋亡和自噬发生。与对照组相比,猪卵巢颗粒细胞经20μM海藻酸处理24 h后,Annexin V/PI凋亡检测结果表明凋亡细胞所占比例显著上升（P＜0.05）,JC-1染色结果表明细胞线粒体膜电位显著下降（P＜0.001）,蛋白免疫印迹检测发现促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3表达量显著上升（P＜0.05）,促自噬蛋白Beclin1表达量显著上升（P＜0.05）,自噬小泡数量显著增多。5.连续35天对小鼠腹腔注射海藻酸溶液（10 mg/Kg）,会抑制小鼠发情和卵巢类固醇激素的合成,小鼠卵巢氧化应激水平升高并发生凋亡。综上所述,20μM的海藻酸可以显著抑制猪卵巢颗粒细胞活力,促使细胞发生氧化应激,引发线粒体介导的凋亡和自噬,最终抑制细胞类固醇激素合成。
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