背景与目的:阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)引起并发症可涉及多个系统,对于中枢神经系统(CNS)来说成人和儿童均引起认知功能障碍,包括嗜睡、注意力下降、记忆力减退、情绪和表达障碍。间歇低氧(IH)是OSA的重要病理生理特征之一,主要通过海马CA1区域神经元的凋亡引起认知功能障碍。CNS IH可引发活性氧簇过度产生,导致炎性物质大量产生致神经元凋亡和坏死并加重OSA相关认知功能障碍。因此本研究通过原代培养海马神经元5-7 d,并进行分组,经低氧暴露后测定不同分组炎症因子的表达水平,从而探讨神经炎症在间歇低氧引起的神经认知障碍中的作用。实验方法:采用孕16-18d SD孕鼠的胎鼠分离其海马神经元细胞,原代培养5-7天后,进行实验。首先进行细胞形态学观察,分别于不同时间采用倒置相差显微镜观察细胞形态,采集细胞形态图像;采用结构性微管相关蛋白-2(MAP-2)标记神经元胞体和树突,DAPI染核进行免疫荧光染色鉴定,在荧光显微镜下观察细胞、采集图像。挑选细胞长势良好、无污染的细胞,随机将细胞分为常氧对照组和间歇低氧组。采用天津医科大学总医院呼吸科仿真系统1.0设置低氧/再氧合循环模式,低氧混合气含1.5%O2、93.5%N2、5%CO2,正常氧混合气含21%O2、74%N2、5%CO2,暴露频率6次/h,暴露时间为4h。再根据暴露后继续常氧培养不同时间将间歇低氧组细胞分为2h组,4h组,6h组,8h组。间歇低氧暴露结束后提取对照组和间歇低氧组海马神经元细胞总mRNA,采用Real Time PCR测定两组细胞高迁移率族蛋白1(HMGB1)mRNA相对表达水平。待常氧培养结束后提取细胞总mRNA和细胞总蛋白水平,利用Real Time PCR和Western blot方法检测对照组和各培养组HMGB1和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)相对表达水平。采用SPSS和GraphPad Prism进行统计分析。结果:(1)培养的海马神经元细胞4h后贴壁明显,少数细胞开始长出1-2个突起,细胞折光性比较强,未见明显细胞核。神经元细胞接种24h后大多数细胞已贴壁,细胞呈圆形或椭圆形且周围有光晕,单个均匀分布,可见有3个突起或多突起的神经元。培养3d后神经元突起增多并变长,胞体变大,细胞聚集成团,可见突起连接成稀疏的网状结构。5d后神经元胞体成三角形、圆形或多边形,突起形成较密集的网络。7d后神经元生长良好,胞体清晰,突起增粗形成致密的神经网络。对培养5-7d的海马神经元细胞采用神经元特异性标志物Map-2和细胞核DAP I染色后在倒置荧光显微镜采用不同激发波长观察,可见绿色神经元突起和胞体以及蓝色荧光的细胞核,两图重叠后可计算神经元所占比例,计算阳性细胞比例在90%以上。(2)IH组和对照组相比较,IH组HMGB1 mRNA相对表达量是对照组的3.203倍,IH组HMGB1 mRNA表达水平明显增高(P<0.05)。IH组暴露后继续培养不同时间各组之间HMGB1mRNA相对表达水平差异明显(P<0.05),其中4H mRNA相对表达量水平最高。约为对照组的8.142倍(P<0.0001),2h HMGB1表达约为对照组的2.836倍(P<0.05),6h约为对照组的0.669倍,与对照组相比表达量减少(P<0.01),8h约为对照组的0.338倍,与对照组相比表达量减少(P<0.01)。与2H相对表达水平相比,4H表达量明显增多(P<0.05);6H与2H相比,6H相对表达水平增加(P<0.05);8H与2H相比,8H相对表达水平增高(P<0.05);6H与4H相比,6H相对表达水平明显增高(P<0.05);8H与4H相比,8H相对表达水平增高(P<0.05)。(3)IH组暴露后继续培养不同时间各组之间NMDA mRNA相对表达水平差异明显(P<0.05),随着正常氧培养时间的延长,各组NMDA mRNA相对表达水平逐渐增高(P<0.05)。2h与对照组相比相对表达水平明显升高(P<0.01),4h与对照组相比相对表达量增加(P<0.001),6h与对照组相比表达水平明显增加,8h与对照组相比表达量增加(P<0.001)。(4)IH组暴露后继续培养不同时间海马神经元细胞内HMGB1蛋白表达水平差异明显(P<0.05),与对照组相比4h蛋白表达水平最高,2h蛋白表达与对照组相比增加,6h蛋白表达水平较对照组相比明显减少,8h蛋白表达水平与对照组相比明显降低。IH组暴露后继续培养不同时间海马神经元细胞内NMDA蛋白表达水平存在明显差异(P<0.05),随着暴露后常氧培养时间延长,海马神经元细胞内NMDA蛋白表达明显增多。8h海马神经元细胞表达NMDA蛋白量最多。结论:神经炎症在OSA IH引起的神经认知功能障碍中发挥重要作用,IH可引起神经炎症因子HMGB1表达。说明神经炎症和损伤的神经元之间形成恶性循环,对神经元造成“二次打击”。即使IH暴露撤除神经元的损伤也持续存在。濒临死亡的神经元持续释放HMGB1对于形成和维持这个恶性循环有重要意义。即使始动因素IH停止后,炎性损伤还能继续。IH可以引起神经炎症,但IH不是维持神经炎症的必须条件。随着炎症持续时间延长,因子HMGB1分泌减少,但NMDA明显增多,表明可能HMGB1和NMDA可能发挥协同作用,引起神经元凋亡和功能障碍。