论文部分内容阅读
赤霉素(Gibberellin acid,GA3)是由藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)发酵产生的一类具有促进植物种子萌发及根、茎生长作用等作用的植物激素,被广泛的应用于农、林、园艺、食品酿造等诸多领域,市场潜力巨大。我国虽有众多厂家生产,但多年发酵水平停滞在1 800 mg/L左右,生产成本偏高制约其应用。本研究将围绕如何提高GA3的产量和质量,在菌种筛选、发酵工艺优化、代谢途径分析、发酵过程建模及补料策略优化和吸附耦合发酵等方面进行较为系统的研究,以期降低生产成本,扩大GA3在相关领域的应用,促进产业发展。具体研究结果如下：1.GA3高产菌株定向筛选以工业生产菌株Gibberella fujikuroi 978#为出发株,针对不产孢、不产色素的多核丝状菌的特性,开展了以生化推理选育(采用脂肪酶活性为初筛指标)以及耐抑真菌剂(制霉菌素或特比萘芬)的抗性GA3高产菌株筛选。对出发菌株菌丝机械断裂获得单细胞悬液后,紫外诱变处理,筛选出4株产赤霉素效价高于出发菌株的突变株,其中菌株GL-2在优化豆油补加工艺后,发酵产赤霉素是菌株978#的1.364倍。抗性筛选中,对菌悬液进行组合诱变后,分别采用抑真菌剂-制霉菌素或特比萘芬进行抗性筛选,其中抗制霉菌素的赤霉菌突变株ZNL-1产赤霉素效价达到2 170μg/mL,较之诱变前发酵效价平均提高了16.7%。抗120μg/L特比萘芬的赤霉菌突变株ZNL13-3产赤霉素效价为2215±35μg/mL,较之诱变前发酵效价平均提高了11.87%。以上各菌株经连续多次试管斜面传代考察,产素性能稳定,能维持原发菌株93.2%以上,具有良好的遗传稳定性和生产应用前景。2.GA3发酵工艺优化采用单因素结合正交分析对发酵营养因素与种子质量标准进行了优化。结果显示：最适宜的GA3摇瓶发酵条件：种龄48 h,接种量10%,装料量20%,温度28℃,初始pH5.5；发酵培养基配比(g/L)：花生粉10,淀粉50,豆饼粉2,无水硫酸镁0.7,磷酸二氢钾0.4,硫酸铵0.01。在此基础上,通过5L发酵罐放大,逐一对发酵过程的pH、T、DO进行优化,并最终通过过程趋势的微分处理获得各环境因素对比生长速度与比生产速率的影响,多方组合及分段处理后,获得关于发酵pH、T、DO的最佳控制轮廓,并实验验证。3.GA3代谢网络途径分析及在前体促进剂筛选中的应用采用静息技术对已发酵至某时刻的Gibberellafujikuroi 978#菌丝进行流化或海藻酸钙凝胶固定培养,确定建立GA3代谢网络途径分析的菌丝菌龄为96h。在此基础上,通过简化GA3合成代谢途径,跟踪考察葡萄糖耗量、GA3合成量、菌丝C18脂肪酸合成量及红色色素(胡萝卜素)生成量,构建发酵96 h赤霉菌的体内合成GA3代谢途径通量分析图,并对外部环境变化(pH、T、DO)干扰菌丝体内代谢情况进行分析,与之前发酵环境优化实验结果比较,能良好切合,具有一定的相互印证,为今后进一步分析、优化菌丝合成代谢分布提供了简洁、快速的方法。通过PB因子筛选和响应面分析,获得GA3发酵过程最佳前体促进剂组合：草酰乙酸0.2086g/L、葡萄糖酸钙0.0482g/L和维生素B20.04096 mg/L,并对补充至发酵体系后,菌丝代谢网络流进行了分析,阐明前体促进剂促进产GA3的生化机理,为进一步分析GA3合成代谢网络提供了充实的实验样本,也将为萜类产物代谢工程的实施提供参考。4.GA3发酵过程建模及补料优化针对Gibberella fujikuroi 978*菌发酵GA3合成过程的氮源阻遏现象,我们将GA3发酵过程分成了菌丝营养生长(0-60h)和菌丝合成产素(60-192 h),采用MATLAB软件对GA3发酵过程进行了微分方程组的拟合,建立赤霉素GA3分批发酵动力学模型及其适用范围,并利用模型探讨了最佳初始碳源浓度、氮源浓度及C/N。在此基础上,采用遗传算法对分批补料发酵的葡萄糖流加策略进行了计算优化。通过流加补料,GA3发酵效价为2210 mg/L,提高了7.91%。此外,我们还尝试采用菌丝平均菌龄进行结构建模,希望将来基于菌丝形态分析建立动力学模型做出基础工作。5.树脂吸附耦合发酵技术针对GA3生物合成过程中存在产物抑制,采用树脂原位吸附提取与发酵耦合技术,减弱产物抑制,提高GA3生产效率。此研究中对多种国产大孔树脂进行静态吸附、解析实验筛选；并采用单因素和响应面分析优化D-100树脂添加至赤霉素发酵的工艺条件。大孔树脂D-100的最适添加时间与最适树脂量分别为71h和2.2%,发酵所得赤霉素总量为221.75 mg,赤霉菌平均比生产速率为0.96 mg/(g-h)。与常规发酵的0.642 mg/(g-h)比较,提高了1.496倍。在此基础上,我们构建磁性GA3分子印迹核壳式微球(Fe3O4@SiO2为核,AM-St-TRIM为壳)MMIPs,解决树脂不能重复使用和非专一性吸附的问题。摇瓶发酵实验表明,MMIPs具有良好的专一性,平均赤霉素效价为220.82±0.36 mg/100nL,赤霉菌平均比生产速率为0.931±0.042 mg/(g·h)。