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为了探究3-酮脂酰-CoA合酶(KCS酶)对于小球藻脂肪酸代谢过程的调控作用,增加超长链不饱和脂肪酸的含量,本文采用农杆菌介导法将碎米荠KCS酶基因转入过表达硬脂酰载体蛋白去饱和酶(SAD酶)基因的改造蛋白核小球藻中,观察外源基因的转入对小球藻脂肪酸合成的影响。实验以pCAMBIA1301质粒为载体转化KCS基因,通过潮霉素抗性筛选阳性转化藻,用相同质粒载体转化GUS基因观察小球藻对所用表达盒的表达能力,采用PCR和RT-PCR验证碎米荠KCS酶基因阳性转化藻,利用高效液相色谱(HPLC)分析脂肪酸合成代谢中间产物,用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法对其分析小球藻脂肪酸组成。本文所完成的基因转化是在前期完成了SAD基因转化的基础上通过农杆菌介导法进行的二次转化,首次获得了同时转化了SAD酶基因与KCS酶基因的蛋白核小球藻,并探究了KCS酶对小球藻脂肪酸合成的影响,为深入探究小球藻脂肪酸代谢的调控机理提供了研究参考。本研究的主要内容及结果如下:(1)成功构建了以双元载体pCAMBIA1301为基础,通过敲除GUS基因,连入碎米荠KCS基因改造而成的重组质粒pCAMBIA1301-KCS,该重组质粒是以原GUS基因表达盒的CaMV35S启动子和NOS polyA终止子为启动子和终止子构建了新的碎米荠KCS基因表达盒。(2)利用农杆菌介导法分别将含GUS基因的原始双元载体pCAMBIA1301和改造质粒pCAMBIA1301-KCS分别转入过表达SAD基因的改造小球藻,通过潮霉素抗性筛选出阳性转化小球藻,并将筛选出的转化小球藻在潮霉素压力下扩大培养。(3)对转入pCAMBIA1301的阳性转化小球藻进行GUS染色,结果表明GUS基因可以在小球藻内成功表达,即GUS基因的表达盒能够在小球藻内有效。(4)对转入pCAMBIA1301-KCS的阳性转化小球藻进行了PCR鉴定,验证了碎米荠KCS基因和潮霉素抗性基因(Hpt)成功转入了小球藻,对KCS基因进行了RT-PCR检测,结果表明KCS基因在小球藻细胞内成功转录。(5)对KCS转化小球藻的代谢产物进行分析,与原有的SAD基因过表达改造小球藻对比可发现,其油脂代谢的中间产物酯酰辅酶A库中,十八碳三烯酰基脂酰辅酶A和棕榈油酰基脂酰辅酶A的含量有了明显增加。(6)脂肪酸结果分析发现:成功转化了外源KCS基因的小球藻的脂肪酸组成中超长链脂肪酸二十二碳三烯酸(C22:3)含量大幅度增加,其在总脂肪酸中的相对含量达到21.27%;而十八碳三烯酸(C18:3)的相对含量出现大幅度降低,由原来含有22.8%降低到只有0.23%;同时还检测到含量为0.05%的不常见的二十二碳烷酸(C22:0);二十四碳烷酸的相对含量也有小幅上升。总之,外源KCS酶对脂肪酸碳链延长起到了明显的作用,但是对延长脂肪酸的特异性与其他文献报道不同。