细胞凋亡(apoptosis)是由基因控制,为了能够更好地适应生存环境涉及一系列基因的激活、表达、调控作用,而主动争取的一种死亡过程。激光光镊子拉曼光谱技术(LTRS)是将激光镊子与拉曼光谱结合的一种新型生物光子技术,溶液中的单个活细胞被高度会聚的激光束形成的三维光陷阱(光镊)所囚禁而固定在激光微束中,再经过瞬时增加的激光强度来激发并获得细胞的拉曼光谱,具有无损伤、灵敏、快速等优势,更重要的是,可以实时观察、无损伤地收集单个活细胞的生理生化变化过程中的变化信息。本课题在线粒体水平上,重点应用LTRS作为单细胞分析工具,结合常规生化分析技术手段,以不同浓度铝离子作为凋亡的胁迫剂,动态记录单个线粒体在铝胁迫过程中的拉曼光谱数据,有助于我们理解不同浓度铝离子胁迫单个线粒体过程中,影响其内部生物大分子变化的原因,揭示铝胁迫植物细胞凋亡更深层次的机理。主要研究结果如下:(1)本研究在4 ℃和25 ℃条件下,蚕豆根尖线粒体的稳定性和完整性,并结合常规生理生化分析手段检测同等条件下线粒体的生理变化进行验证。结果显示,归属于核酸的谱峰(825和1262cm-1),细胞色素C(Cytc)的特征峰(750和1127cm-1),线粒体呼吸特征峰(1602 cm-1),主要成分磷脂的谱峰(1065、1127和1457cm-1),蛋白质的谱峰(750、930、1262、1330、1360、1457和1602 cm-1),在两种保存条件下,均随着时间的延长而降低,但是在2h时,与对照相比,在4℃条件下的下降幅度远远小于25℃条件下的下降幅度;用常规分析方法检测的线粒体呼吸率(RCR),磷氧比(P/O),Cytc氧化酶活性,NADH氧化酶活性,琥珀酸氧化酶活性,在两种保存条件下2h时,与对照相比,在4 ℃条件下的下降幅度远远小于25 ℃条件下的下降幅度。说明4 ℃保存条件下的线粒体比25 ℃保存条件下的线粒体稳定性和完整性好,在进行有关离体线粒体实验研究时最好是保证在4 ℃条件下2 h内完成,也说明了 LTRS技术在单个线粒体水平上是一种非入侵性、快速、有效分析离体线粒体的有用工具。(2)以铝离子作为胁迫剂,研究铝离子胁迫蚕豆根尖细胞后其线粒体内生物大分子含量的变化,并结合常规生理生化分析手段检测同等条件下线粒体的生理变化进行验证。结果显示,归属于Cytc的特征峰,核酸的谱峰,磷脂的谱峰,蛋白质的谱峰,线粒体呼吸特征峰均随着铝离子浓度的增加而降低,与常规检测方法检测的根伸长量,RCR,P/O,Cytc氧化酶活性,Cytc含量,Cytc/a均随着铝离子浓度的增加而降低,丙二醛(MDA)含量随着铝离子浓度的增加而升高这一结果相似。说明随着诱导程度的加深,膜脂过氧化程度加深,线粒体内蛋白质、核酸、脂类,Cytc逐渐被释放到胞浆中,呼吸功能降低,影响蚕豆正常生长,从而进一步引起细胞的凋亡。(3)以铝离子作为胁迫剂,研究正常蚕豆根尖细胞的离体线粒体在胁迫剂的胁迫下,线粒体内生物大分子含量的变化,并结合常规生理生化分析手段检测同等条件下线粒体的生理变化进行验证。结果显示,归属于Cytc的特征峰,核酸的谱峰,磷脂的谱峰,蛋白质的谱峰,线粒体呼吸特征峰,均随着铝离子浓度和诱导时间的增加而降低,与常规法检测的RCR,P/O随着铝离子浓度和诱导时间的增加而降低这一结果相似。说明铝离子胁迫正常的离体线粒体时会导致线粒体内蛋白质、核酸、脂类,Cytc的释放,呼吸功能降低。铝离子胁迫蚕豆根尖细胞后提取线粒体,以及铝离子直接胁迫离体线粒体,归属与核酸、蛋白质、脂类、Cytc、线粒体呼吸特征峰强度均随着胁迫程度的加深而降低。表明在铝离子胁迫蚕豆根尖细胞过程中,铝离子进入到细胞内可能直接作用于线粒体,导致线粒体膜脂过氧化程度加深,线粒体内的核酸、蛋白质、脂类、Cytc含量的降低,呼吸功能衰竭,出现依赖于线粒体途径的细胞凋亡现象。