背景:肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一种常见的胃肠道功能紊乱性疾病,以腹痛伴排便习惯改变为特征。病因和发病机制迄今仍不明确。近年来发病率呈逐年上升趋势,且患者多以年轻人和中年人为主,在西方国家人群发病率约为15%～20%,我国约为5%～10%。IBS可严重影响患者的生活质量,导致大量的医疗费用。近年来研究发现,IBS的发病率在肠道感染后显著增加。患者被肠道病毒、细菌或寄生虫等感染,在病原体清除及黏膜炎症逐渐消退后,出现IBS症状,称之为感染后肠易激综合征(post-infectious irritable bowel syndrome,PI-IBS)。PI-IBS以腹泻型IBS (D-IBS)多见,其比例可达70%以上。PI-IBS作为一种常见的IBS类型,近来受到越来越多的关注。近年临床研究表明,IBS患者存在不同程度的肠黏膜屏障损伤。肠道炎症反应可对肠黏膜上皮屏障和肠黏膜免疫系统产生影响,导致肠功能紊乱,从而诱发IBS状态。PI-IBS的发病机制与持续的低度肠道炎症、结肠通透性增高、免疫机制的异常密切相关。肠道炎症(尤其是急性胃肠炎)后持续存在的低度炎症可破坏肠黏膜上皮屏障功能,增加其通透性,引起水钠吸收障碍而产生腹泻,同时也引起抗原的过度暴露以及刷状缘的缺失,从而激活肠黏膜免疫系统,引起包括肥大细胞、淋巴细胞、内分泌细胞在内的各种炎症及免疫细胞增加,释放多种细胞因子,也使炎症介质表达增加。肠道内的菌群紊乱也参与低度炎症的发生,主要是肠道内细菌过度生长。另外,肠道感染后抗生素应用不当,也可能导致肠道菌群失调。如何控制PI-IBS症状和预防其发生是目前研究的热点。西医治疗PI-IBS多采用对症治疗,尚无特效药物。中医药治疗具有多靶点及副作用少的优势,在辨病基础上辨证论治,随症加减,在治疗IBS方面取得了比较显著的疗效。PI-IBS主要表现为腹痛或腹部不适,排便次数增加,稀便,黏液便,排便急迫感,属中医学“腹痛”、“泄泻”、“下利”等范畴。有中医学者认为,脾虚湿困为发病关键,湿邪阻滞是IBS反复发作的重要病理因素。藿香正气散出自宋代《太平惠民和剂局方·治伤寒》,功擅治湿,被历代医家尊为“祛湿圣药”。藿香正气散具有疏畅中焦气机,宣化湿浊,运脾醒胃之功效,对湿邪停滞,脾胃不和所致外感及内伤腹泻具有明确的止泻作用。有临床报道,藿香正气制剂对D-IBS具有确切的临床疗效。其双向调整胃肠动力,改善免疫炎性不平衡状态,降低内脏敏感性及调畅心神的作用,提示该方可能成为防治PI-IBS的理想药物。目前国内外关于藿香正气制剂对IBS治疗作用的实验研究多集中于对D-IBS动物的胃肠激素、胃肠动力学、内脏痛敏机制、神经-内分泌-免疫网络、水液代谢等方面,尚未针对PI-IBS肠黏膜屏障功能的保护和调节作用进行系统研究。因此,本课题通过深入研究PI-IBS发生发展与肠黏膜屏障功能异常之间的关系以及藿香正气口服液对PI-IBS肠黏膜屏障的保护与调节作用及其机制,为藿香正气制剂治疗PI-IBS的临床应用提供实验依据,故本课题具有重要的理论意义和应用前景。目的:1.观测PI-IBS模型动物结肠黏膜屏障功能的改变,初步阐释PI-IBS的发病机制,揭示PI-IBS发生发展与肠黏膜屏障功能异常之间的关系。2.开展藿香正气液对PI-IBS的药效学研究,揭示其对PI-IBS肠黏膜机械屏障、免疫屏障、生物屏障的保护与调节作用机制,为藿香正气制剂治疗PI-IBS的临床应用提供实验依据。方法:采用结肠灌注乙酸的方法建立PI-IBS模型。根据动物一般情况,包括大便性状、大便含水量、腹部撤离反射(AWR)检测,以及远端结肠组织病理学检查结果评估模型复制是否成功。模型建立成功后,阳性药物组灌胃马来酸曲美布汀片(TrimebutineMaleateTablets,TMT,0.1g/kg),藿香正气低、中、高剂量组分别灌胃藿香正气口服液(1.7, 3.3, 6.6 ml/kg),正常对照组和PI-IBS模型组灌胃等体积的生理盐水,每日1次,连续5天。给药结束后,处死动物取材。采用ELISA的方法检测各组大鼠血清二胺氧化酶(diamine oxidase. DAO)活性,采用透射电镜观察结肠黏膜上皮细胞超微结构(重点观察上皮细胞紧密连接),采用免疫组化和Western blot检测结肠黏膜紧密连接(tight junction,TJ)蛋白zonulaoccludens-1(ZO-1)以及闭锁蛋白occludin的分布、含量和蛋白表达,以上指标用于研究藿香正气液对PI-IBS肠黏膜机械屏障的保护作用及其机制。采用ELISA方法检测血清免疫球蛋白(SIgA)以及血清Th1和Th2型细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10的含量,采用免疫组法检测结肠黏膜Nuclear factor-κB p65 (NF-κkB p65 )、p3 8 mitogen-activated protein kinase (p3 8 MAPK)、细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)的蛋白表达,以上指标用于研究藿香正气液对PI-IBS肠黏膜免疫屏障的调节作用及其机制。以动物粪便菌群分析及肠道微生物定植抗力(双歧杆菌与肠杆菌的数量比值B/E值)为评价指标,研究藿香正气液对PI-IBS肠黏膜生物屏障的调节作用及其机制。结果:1.各组大鼠在造模当天开始出现精神萎靡,反应迟钝,稀便,食量减少,肛周污秽。自第4天开始,动物毛发光泽度及精神状态均有好转,大便仍为稀便。感染后第7天,与正常对照组比较,其余各组动物活动欠佳,皮毛欠光泽,大便稀软,体重低于正常对照组(P<0.05)。给药期间,藿香正气低剂量组症状缓解较慢。藿香正气中、高剂量组症状明显好转,大部分大鼠稀烂大便逐渐成形,毛色渐有光泽,进食量增加接近正常,活动增多,体重增长。模型组体重低于正常对照组(P<0.01 )。大便湿重与大便含水量均高于正常对照组(P<0.01 )。有的直至处死前仍有稀便或半稀便。阳性药物组,动物的稀便症状消失,而精神状态、毛色光泽度、饮食量均不及藿香正气中、高剂量组。HE染色镜检结果显示,各组大鼠结肠黏膜组织均未见明显异常。2.透射电镜下观察到:PI-IBS模型组上皮细胞表面的微绒毛稀疏,分布密度不均,长短不一,有微绒毛断裂现象。上皮细胞中可观察到较多肥大细胞,其内充满高电子密度颗粒和一些脱颗粒后的空泡,呈活跃的脱颗粒状态。藿香正气低、中、高剂量组,上皮细胞膜完整,细胞形态正常,微绒毛排列较为整齐。各治疗组中以藿香正气高剂量组对受损的结肠上皮细胞的超微结构改善最为明显。模型组血清DAO含量高于正常对照组(P<0.05)。藿香正气低、中、高剂量组血清DAO含量低于模型组(P<0.05, P<0.01)。各给药组血清DAO含量与正常对照组之间的差异无统计学意义。免疫组化分析结果显示,PI-IBS模型组结肠黏膜组织中ZO-1和occludin染色分布不均或褪色,蛋白表达低于正常对照组(P<0.05, P<0.01)。经藿香正气液治疗后,ZO-1和occludin蛋白表达增强,其IOD值均高于模型组(P<0.001)。而TMT组ZO-1、occludin蛋白表达与模型组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot分析结果显示,模型组、TMT组和藿香正气低剂量组结肠黏膜ZO-1和occludin蛋白表达OD值均低于正常对照组(P<0.05,P<0.01,P<0.001 )。藿香正气中、高剂量组ZO-1和occludin蛋白表达OD值高于模型组(P<0.05,P<0.01, P<0.001),且与正常对照组之间无显著性差异。藿香正气低剂量组occludin蛋白表达OD值高于模型组(P<0.01),但仍低于正常对照组(P<0.01)。TMT组结肠黏膜ZO-1和occludin蛋白表达OD值与模型组之间的差异无统计学意义。3.与正常对照组比较,模型组、TMT组和藿香正气低剂量组血清SIgA含量显著降低(P<0.01)。藿香正气中、高剂量组血清SIgA含量与正常对照组比、较无显著性差异。各组大鼠血清TNF-α、IL-4的含量均无显著性差异。模型组血清IL-1β含量高于正常对照组,IL-10含量低于正常对照组(P<0.05, P<0.01);各给药组IL-1β,IL-10含量与正常对照组比较均无显著性差异。藿香正气中、高剂量组血清IL-10含量较模型组显著增加(P<0.05, P<0.01)。免疫组化分析显示,模型组结肠黏膜组织可见NF-κB p65大量表达,IOD值高于正常对照组(P<0.001)。藿香正气低、中、高剂量组IOD值较模型组均显著降低(P<0.05),与正常对照组比较,差异无统计学意义。TMT组IOD值高于正常对照组(P<0.001),与模型组比较,差异无统计学意义。正常对照组大鼠肠黏膜p38MAPK表达为弱阳性,模型组可见p38MAPK大量表达。藿香正气低、中、高剂量组和TMT组p38MAPK的IOD值均低于模型组(P<0.05);正常对照组ICAM-1蛋白在肠黏膜固有层极少量表达。模型组ICAM-1蛋白表达高于正常对照组(P<0.01)。藿香正气中、高剂量组ICAM-1的IOD值均低于模型组(P<0.05),与正常对照组比较无显著性差异。4. PI-IBS大鼠粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌数量与正常对照组比较显著减少,而大肠杆菌、肠球菌数量变化不明显。经藿香正气液治疗后,双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显上升(P<0.01),但仍明显低于正常对照组(P<0.01)。治疗前后,各组大鼠粪便中大肠杆菌、肠球菌的数量变化均无明显差异(P>0.05)。实验第7天,正常对照组大鼠B/E>1,其余各组B/E<1。实验第12天,各给药组大鼠B/E值较给药前均明显升高(P<0.001),且显著高于模型组(P<0.01),但仍低于正常对照组(P<0.01)。实验第7天,模型组和各给药组大鼠粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌数量均低于正常对照组(P<0.001);实验第12天,模型组和各给药组粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌数量与第7天比较有增多(F=51.517, P=0.000; F=26.881,P=0.000),但仍低于正常对照组(P<0.01)。藿香正气低、中、高剂量组双歧杆菌、乳酸杆菌数量高于模型组(P<0.001)。各组大鼠粪便标本中大肠杆菌、肠球菌不随时间变化而变化(F=0.599, P=0.701,F=0.910,P=0.484),且组间差异均无统计学意义。实验第7天,正常对照组大鼠B/E>1,其余各组B/E<1,小于正常对照组(P<0.001)。实验第12天,模型组和各给药组大鼠B/E值较实验第7天均有升高(F=11.154, P=0.000);各给药组大鼠B/E值高于模型组(P<0.01),但仍低于正常对照组,差异有统计学意义(P <0.01)。结论:1.本研究采用结肠内灌注乙酸诱导大鼠结肠急性炎症,自行恢复6天,炎症消退后,出现肠道感觉运动功能的异常,即内脏敏感性明显降低,而肠道组织病理学检查无明显异常。这种急性肠道感染后的肠功能紊乱与人类的PI-IBS很相似,可以作为研究PI-IBS的动物模型。2. PI-IBS模型动物存在肠黏膜机械屏障损伤,表现为PI-IBS大鼠肠黏膜屏障上皮细胞超微结构改变,血清中DAO含量增加,紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达水平下降。藿香正气液通过修复受损的肠黏膜上皮细胞的超微结构,促进ZO-1和occludin的表达,进而降低肠道通透性,保护肠黏膜机械屏障。3. PI-IBS大鼠存在免疫屏障功能失调,表现在SIgA分泌减少,促炎与抗炎因子的失衡,NF-κB p65、p38MAPK激活以及ICAM-1的过度表达。藿香正气液通过促进SIgA分泌,调节促炎/抗炎因子水平,抑制NF-κB p65、p38 MAPK、ICAM-1的表达,从而发挥对PI-IBS免疫屏障的调节作用。4. PI-IBS大鼠肠道菌群失调表现在肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌数量减少,肠道微生物定植抗力显著降低。藿香正气液对肠道菌群失调有一定的调整作用,PI-IBS大鼠经治疗,肠道双歧杆菌、乳酸杆菌的数量以及B/E值显著增加。藿香正气液不是通过直接补充肠道有益菌群来发挥调整肠道菌群的作用,可能是通过修复肠道机械屏障和调节肠道免疫屏障来间接作用于肠道菌群。