引言与目的:结直肠癌(或简称肠癌)是目前临床发病率较高的恶性肿瘤之一,其发病率不断上升,预计2025年我国新增肠癌人数将居世界第一,肠癌的三级预防压力将越来越突出。早期诊断是制约结直肠癌患者生存期的瓶颈,但是,现有的影像学诊断措施及肿瘤标志物检查往往难以早期诊断,肠癌也不例外,虽然有CA199等糖基抗原及癌胚抗原等肿瘤标志物,但它们仍不够理想,仍不能早期诊断肠癌,迫切要求开发更多更好的肿瘤标志物。将来可望从分子水平去进行更早期诊断,需要发现一些易感基因协助诊断,结直肠癌尚未有较好的易感基因。结直肠癌具体的发病原因及发病机制仍不是很清楚,既有环境的因素也有遗传的因素参与,是多个因素多个步骤的病理过程。结直肠癌的个体易感性差异与某些基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)有关,遗传易感性与环境因素的交互作用在结直肠癌发病过程中起着重要的作用。外部环境因素可通过影响或损伤载有相关基因载体的DNA稳定性,从而导致细胞出现或发生恶性突变,形成恶性肿瘤。载有相关基因载体的DNA稳定性与肿瘤的发生密切相关,基因受损伤后DNA的修复能力至关重要,因此DNA修复基因多态性与恶性肿瘤易感性存在一定关系。人类 X 射线交错互补修复基因 1(X-ray repair cross complementing genel,XRCC1)是第一个被发现与细胞受电离辐射敏感的哺乳动物基因,定位于人类染色体19q13.2-19q13.3,分子量为33kb,广泛参与DNA损伤后的修复,在碱基切除修复和单链断裂修复中均发挥重要作用。XRCC1作为分子支架,参与染色体的运动、有丝分裂和细胞凋亡,其异常表达及分布可能与肿瘤发生、细胞增殖失控,以及肿瘤细胞的恶性生物学行为如无限生长、侵袭和转移等密切相关。XRCC1常有基因多态性,其基因多态性很可能会影响XRCC1编码蛋白的功能,进而影响恶性肿瘤易感性的发生。XRCC1基因多态性主要有三个位点,分别是 C26304T(Arg194Trp)、G27466A(Arg280His)、G28152A(Arg399Gln),本文分别简称194、288和399位点,目前研究最多的是399位点。既往研究认为XRCC1基因多态性与食管癌、宫颈癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展有关。近年来国内外也广泛开展了关于XRCC1基因多态性与肠癌易感性的相关性的研究,但目前尚无明确定论,每个位点的研究结果也不完全一致。主要是因为研究所纳入的样本量较小,统计学考察的有效力不充分,因此有必要将各个规模不大的样本综合在一起统计分析即进行Meta分析,或者增加样本量进一步深入地探究XRCC1基因与肠癌易感性之间的关系。这是我们选择XRCC1作为我们对肠癌病因及机制研究为突破口的理由。将有助于为肿瘤分子流行病学领域做出贡献,寻找肠癌的早期诊断策略做出贡献。虽然结直肠癌的临床治疗水平取得了较大水平的进步,但结直肠癌的治愈率仍较低[5]。因此研究肠癌的治疗方法及临床疗效是目前临床的热点和前沿。肠癌治疗方法逐步形成以手术治疗、放、化疗及分子靶向治疗的综合性治疗方法。化疗在肠癌综合治疗中发挥了非常重要的作用,尤其是转移性肠癌。含铂新药联合化疗能显著延长中晚期肠癌生存期,并提高生活质量。但是,化疗效果存在很大的个体差异。影响结直肠癌患者化疗效果及生存的主要原因是肿瘤细胞对抗癌药的敏感性。有文献提示,XRCC1基因多态性可能与结直肠癌对化疗药物尤其铂类化疗药物的敏感性相关,与化疗的毒性反应也有一定相关性,但是还存在分歧。因此,我们做了进一步观察,以便评判该基因多态性对肠癌化疗疗效的预测价值。总之,本课题组为了观察XRCC1基因多态性与结直肠癌易感性的关系以及该基因多态性与结直肠癌对化疗药物敏感性的关系,我们拟从以下三方面进行研究:第一部分,查阅大量的关于XRCC1基因多态性与结直肠癌易感性的关系的相关文献,采用系统评价与Meta分析方法分析XRCC1基因多态性与结直肠癌易感性的关系。第二部分,实验观察XRCC1基因三个位点多态性与结直肠癌易感性的关系。第三部分,XRCC1基因多态性与结直肠癌对化疗药物疗效及毒性反应的影响。第一章:XRCC1 Arg399Gln基因多态性与结直肠癌易感性关系的Meta分析目的:定量总结XRCC1Arg399Gln多态性与结肠直肠癌(CRC)易感性之间的关联性。方法:1.全面检索以下电子数据库:PubMed(1966年1月-2012年9月)、Embase(1988年1月-2012年9月)、中国生物医学文献光盘数据库(CBMDISC,1981-2012.9),收集国内外已发表和未发表的相关文献,无语言限制。检索截止日期:2012.9.31。检索词包括关键词和MeSH主题词术语。其中中文检索词:"肠癌"、"结肠癌"、"直肠癌"、"结肠直肠癌"等;英文检索词:"XRCC1"、"X-ray repair crosscomplementing group1"、"rs25487" "Arg399Gln" or"G399A"、"colon cancer"、"colon carcinoma"、"rectum cancer"、"rectal cancer,rectal carcinoma"、"colorectal cancer"、"colorectal carcinoma"、or "CRC";and "polymorphism" or "polymorphisms"等。同时我们对文献的参考文献部分也进行了手工检索以便检索到额外的文献。2.统计学分析:所有的分析通过使用软件Stata version 12.0(StataCorpLP,College Station,TX)得到,所有 P 值均为双侧。按照 Hardy-Weinberg(HWE)遗传平衡定律等多种方式评价文献质量,通过拟合优度的试验对对照组的基因多态性分布做出评估,如P<0.05认为有统计学意义。结局变量为优势比(odds ratio,OR),采用Z检验来评价合并的OR值的意义,按照它们的相应的95%可信区间估算,如P<0.05则有显著意义。采用基于卡方的Q统计试验(Cochran’s Q统计)进行异质性检验,如P<0.05则有显著意义。用I2统计评价所有原始文献变量的均衡性,评价异质性时,统计数据资料时按照异质性分析结果分别使用DerSimonian和Lairdsuiji随机效应模型,或者使用Mantel and Haenszel固定效应模型。根据对照组中的种族和HWE进一步采用亚组分析办法分析原始文献数据的异质性。采用单个研究的连续遗漏执行的办法进行敏感性分析。采用Begg’s的漏斗图和Egger’s的加权回归测试方法来评估发表偏倚。结果:XRCClArg399Gln基因多态性与结直肠癌患病易感性之间的相关性的Meta分析:1.原始文献基本特征:共纳入了 26个病例对照试验,其中患者6979例、对照11470例。其中22篇文献为英语文献,4篇为中文文献。纳入的这些研究分别是在中国、奥地利、埃及、印度、意大利、日本、韩国、墨西哥、挪威、波兰、新加坡、西班牙、土耳其、台湾和美国等地进行的。所有26个研究中包含了以下种族群:高加索人:共13篇文献,其中3202例结直肠癌患者和5564例对照;亚洲人:共11篇文献,其中3626例结直肠癌患者和5564例对照;非洲人:1篇文献,其中48例结直肠癌患者和48例对照。种族不详者1篇,因缺乏相关信息。所有研究的对照组的基因型分布按照HWE标准排除了 4篇文献。因此,按照质量评价标准划分,共有22篇高质量文献、4篇低质量文献。2.森林图:反映了 XRCC1 Arg399Gln的基因多态性与结直肠癌患病易感性之间的相关性。总体而言,基于原始文献整体的Meta分析显示:同XRCC1 Arg399Gln的野生G等位基因相比,XRCC1 Arg399Gln的变异等位基因A与结直肠癌的关联性增加(A与G优势比ORAvs.G=1.13,95%置信区间为 1.03-1.23,POR=0.008)。合并的结果显示:在所有病例对照的基因型模型中有3组的XRCC1 Arg399Gln的基因多态性与结直肠癌患病易感性显著相关(分别是:ORGln/Gln vs.Arg/Arg=1.24,95%置信区间CI为1.04-1.46,,POR 0.015;ORGin/Gln vs.Arg/Gln + Arg/Arg=1.19,95%CI 1.03-1.38,POR=0.021;ORGln/Gln + Arg/Gln vs.Arg/Arg=1.14,95%CI 1.02-1.28,POR=0.022)。而在另外的对照模型中没有发现两者的显著关联((ORArg/Glnvs.Arg/Arg=1.1 1,95%CI 0.99-1.25,POR0.064)。3.分层分析:根据种族的不同采用分层分析,以及采用HWE用于对照组的分析,在分层分析中,在高加索人中其合并的ORs值提示XRCC1 Arg399Gln多态性与结直肠癌易感性之间的关联度并不显著。而在亚洲人群中,所有五个基因模型均提示XRCC1 Arg399Gln的基因多态性与结直肠癌患病易感性显著相关。(ORAvs.G=1.19,95%CI:1.04-1.37,POR=0.013;ORGln/Gln vs.Arg/Arg=1.35,95%CI:1.04-1.76,POR=0.026j ORArg/Gln vs.Arg/Arg=1.25,95%CI:1.03-1.50,POR=0.021;ORGln/Gln vs.Arg/Gln +Arg/Arg=1.24,95%CI 1.06-1.45,POR=0.007;ORGln/Gln + Arg/Gln vs.Arg/Arg=1.26,95%CI:1.05-1.53,POR=0.014)。更高质量的Meta分析表明在三种基因模式中XRCC1 Arg399Gln基因多态性与结直肠癌癌易感性之间是适度相关的(ORAvs.G=1.11,95%CI:1.01-1.22,POR=0.036;ORGln/Gln vs.Arg/Arg=1.22,95%CI:1.00-1.49,POR=0.048;ORGln/Gln vs.Arg/Gln + Arg/Arg=1.20,95%CI:1.01-1.43,POR=0.041)。c.异质性与敏感性分析:全部文献中等位基因组、杂合突变基因组、纯合突变基因组中存在显著异质性,Avs.G,I2=62.1%,PH=0.001;Arg/Gln vs.Arg/Arg,I2=57.8%,PH0.001;Gln/Gln + Arg/Gln vs.Arg/Arg,I2=61.7%,Ph<0.001。亚洲人群中异质性是显著的,而高加索人中异质性不明显,说明种族是不同研究间的异质性的主要来源之一。4.发表偏倚:漏斗图评价了所有纳入的纯合基因模型研究的发表偏倚(PEgger=0.135)。而且,所有对照模型的漏斗图的形状没有发现明显的不对称的证据,所有Egger’s的加权回归测试的P值均大于0.05,提供了漏斗图"对称的统计证据。结论:1.整体分析中XRCC1 Arg399Gln三种基因模型多态性与结直肠癌癌易感性之间是适度相关的;2.在亚洲人群中XRCC1 Arg399Gln的基因多态性与结直肠癌患病易感性显著相关,而高加索人(白种人)中XRCC1 Arg399Gln多态性与结直肠癌易感性之间的关联度并不显著。3.为了全面深入理解XRCC1基因多态性与结直肠癌易感性的关系,今后的研究还需探究基因-基因、基因-环境相互影响与肠癌发生风险的相关性。为结直肠癌的病因学及相关预防和治疗提供一定的理论依据。第二章:XRCC1基因各位点多态性与结直肠癌易感性的关系的实验研究目的:分别观察XRCC1Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln等三个位点基因多态性与结直肠癌易感性的关系。方法:1.采用病例对照研究方法,选取200例结直肠癌患者、248例健康对照者外周血标本进行以下实验:提取DNA,PCR扩增,RT试剂盒逆转录合成cDNA,酶切等,Western Blot法检测蛋白质,用凝胶分析系统测定光密度值并分析。对XRCC1基因194、280和399三个位点不同基因型的PCR产物进行序列分析。2.统计学处理:采用用统计学软件IBM SPSS20.0进行分析,采用MassARRAY方法检测XRCC1基因多态位点基因型分布情况。应用卡方检验分析肠癌组及对照组基因型及基因频率分布是否存在区别。应用t-检验或秩和检验分析各基因型之间肠癌相关指标是否存在差别。应用logistic回归分析XRCC1基因各位点多态性与肠癌发生风险的相关性。结果:1.入选研究对象一般资料:入选结直肠癌组病例200例,其中男120例,女80例,年龄24-71岁,平均年龄52.3±5.34岁,包括结肠癌81例、直肠癌119例,男女性别比为120:80。另选取同期我院体检科体格检查健康的248例志愿者作为健康对照组,其中男149例,女99例,平均年龄52.5±5.36岁。两组研究对象性别和年龄无显著性差异,具有可比性,P>0.05。2.XRCC1基因多态性与肠癌及其表型的关系研究:本研究中入选对象全血DNA提取结果,测定A260/A280>1.70,表明本研究中测定的DNA符合PCR实验DNA纯度要求。琼脂糖凝胶电泳结果可见入选研究对象DNA外周血提取DNA成功,琼脂糖凝胶结果可见单一的清晰DNA条带,DNA片段完整,表明提取DNA质量较好,可用于下一步实验。本研究中入选对象XRCC1蛋白提取结果,Western blot检测结果可见入选研究对象XRCC1蛋白提取成功,western blot条带见单一的清晰条带,表明XRCC1蛋白表达在入选对象样本中具有表达,可见XRCC1蛋白表达的均一性。对XRCC1基因194、280和399三个位点不同基因型的PCR产物进行序列分析,测定结果与Pubmed查阅对应的位点基因型序列相一致。3.各基因位点多态性与结直肠癌的易感性的相关性:XRCCI基因194位点的CC、CT、TT基因型在健康对照组中的频率为51.6%、41.1%、7.3%,肠癌组中的频率为50.0%、40.0%、10.0%。与CC基因型相比,携带CT基因型者其肠癌的发病风险无显著差异,ORCT对cc=0.995,95%CI:(0.672,1.474),P=0.979;与CC基因型相比,携带TT基因型者其结直肠癌的发病风险无显著差异,OR-TT对cc=1.411,95%CI:(0.699,2.848),P=0.321。同样地,与 CC 基因型相比,含T的基因组(CT+TT)的患者与结直肠癌的发病风险也无相关性,ORcT+TT对cc=0.937,95%CI:(0.645,1.360),P=0.731。因为经过统计分析证实,年龄和性别无显著差别,未对年龄和性别进行OR调整。XRCCI基因280位点的GG、AG、AA基因型在健康对照组中的频率为79.0%、19.0%、2.0%,肠癌组中的频率为85.0%、13.5%、1.5%。与GG基因型相比,AG基因型的肠癌发病风险无显著差别,ORAG vs.GG=1.503,95%CI:(0.896,2.520),P=0.123;与 GG基因型相比,AA基因型的肠癌发病风险也无显著差别,ORAAVs.GG =1.476,95%CI:(0.345,6.308),P=0.599。与GG基因型相比,携带含A基因组(AG+AA)基因型的患者与肠癌的发病风险也无相关性ORAA+AGvs.GG=1.500,95%CI:(0.914,2.460),P=0.108。因为经过统计分析证实,年龄和性别无显著差别,未对年龄和性别进行OR调整。XRCCI基因399位点的GG、GA、AA基因型在健康对照组中的频率为48.0%、50.0%、2.0%,肠癌组中的频率为44.0%、48.0%、8.0%。与GG基因型相比,携带GA基因型者其肠癌的发病风险无显著的差异,ORAGvs.GG =0.949,95%CI:(0.635,1.419),P=0.799;与 GG 基因型相比,携带AA基因型者其肠癌的发病风险有显著的差异,ORAAvs.GG =0.228,95%CI:(0.080,0.647),P=0.005。与GG基因型相比,携带含A基因组(AG+AA)基因型的患者与肠癌的发病风险无显著的差异,ORAA+GAvs.GG=0.832,95%CI:(0.563,1.230),P=0.357。因为经过统计分析证实,年龄和性别无显著差别,未对年龄和性别进行OR调整。结论:1.XRCC1Arg399 Gln基因多态性与结直肠癌易感性之间有显著的相关性。2.XRCC1Arg194Trp基因多态性与结直肠癌易感性之间没有显著的相关性。3.XRCC1Arg280His基因多态性与结直肠癌易感性之间没有显著的相关性。4.今后的研究还将收集更多的样本,通过加大样本量进一步验证和深入探讨XRCC1基因与肠癌易感性的关系。还需要全面考虑其他各种相关因素,如环境因素,遗传因素以及患者的个体因素、生活习惯、种族差异等。通过对多种可能产生影响的因素进行综合分析,进一步建立XRCC1多态性与结直肠癌易感性之间的明确关系。第三章XRCC1 Arg399Gln基因多态性与结直肠癌对化疗药物敏感性及毒性反应的研究目的:探索XRCC1Arg399Gln基因多态性与以奥沙利铂为基础的化疗方案治疗结直肠癌有效率及毒副反应的关系。方法:1.选取晚期结直肠癌患者125例治疗前的外周血,包括结肠癌52例、直肠癌73例,其中男71例,女54例,94例行改良FOLFOX4方案化疗,31例行XELOX方案化疗。2.采用聚合酶链反应--连接酶检测反应(PCR.LDR)等方法对125例结直肠癌患者进行XRCC1基因多态性检测。对XRCC1基因399位点不同基因型的PCR产物进行序列分析,测定结果与Pubmed查阅对应的位点基因型序列相一致。3.统计学方法:采用统计学软件IBM SPSS20.0进行分析,采用MassARRAY方法检测XRCC1基因多态位点基因型分布情况。应用交叉表及卡方检验分析各基因型与化疗药物疗效之间的相关性是否有显著性差别。应用卡方检验考察XRCC1399基因型多态性与化疗不良反应相关性。结果:1.入选研究对象一般资料:结直肠癌患者125例,包括结肠癌52例、直肠癌73例,其中男71例,女54例,年龄26-73岁,平均年龄55.2岁。96例晚期大肠癌患者治疗前外周血,其中结肠癌42例,直肠癌54例。依据2002UICC的TNM国际分期系统,其中III期43例,IV期82例。2.化疗效果:94例行改良FOLFOX4方案化疗,31例行XELOX方案化疗。XRVC1399Arg/Arg基因型有效31例,占68.89%,疾病进展14例,占31.11%;而Arg/Gln基因型有效29例,占45.31%,疾病进展35例,占54.69%;Gln/Gln基因型有效6例,占37.50%,疾病进展10例,占62.50%。经过交叉表(行×列表)检验,pearson x2=7.617,P=0.022。说明三种基因型之间的有效率存在差异。然后用卡方检验每两组间的差异,发现:Arg/Arg基因型与Gln/Gln基因型之间有显著差异,x2=15.254,P=0.000;Arg/Gln基因型与Gln/Gln基因型之间有显著差异,x2=28.80,P=0.000;而Arg/Arg基因型与Arg/Gln基因型之间没有显著差异,x2=2.604,P=0.73。即Arg/Arg基因型与Arg/Gln基因型肠癌患者化疗疗效显著高于Gln/Gln基因型的患者,其疾病进展率显著低于Gln/Gln基因型患者。3.不良反应:XRCC1Arg399Gln基因多态性与白细胞、血红蛋白无统计学差异,P值大于0.05;而携带Arg/Arg基因型患者发生谷丙转氨酶变化、血小板变化、恶心呕吐、腹泻、口腔黏膜炎以及神经毒性病例数与携带Arg/Gln或Gln/Gln基因型患者比较具有显著性差异,P<0.05。结论:1.结直肠癌患者XRCClArg399Gln基因多态性与FOLFOX4治疗方案疗效具有相关性,带有Arg/Arg和Arg/Gln基因型的患者有效率显著高于Gln/Gln基因型患者,而Arg/Arg和Arg/Gln基因型组疾病进展率显著低于Gln/Gln基因型组。2.XRCClArg399Gln基因多态性与有些毒副反应也具有相关性,携带Arg/Arg基因型患者发生谷丙转氨酶变化、恶心呕吐、腹泻、口腔黏膜炎以及神经毒性等病例数较携带Arg/Gln或Gln/Gln基因型患者增多。而Arg/Arg基因型患者发生血小板减少的机会较携带Arg/Gln或Gln/Gln基因型患者减少;白细胞、血红蛋白减少等发生率方面两组没有差别。3.研究仍需继续扩大样本数以获得更为准确的研究结果,虽然本研究中入选对象出现的化疗不良反应与XRCC1Arg399Gln基因多态性具有一定的统计学意义,但仍只是一种经验医学,需要今后循证医学的进一步证明。全文总结1、XRCC1Arg399Gln基因多态性与结直肠癌间有显著的相关性,可望成为成为肠癌发病风险的预测指标。XRCC1Arg194Trp、XRCC1Arg280His与结直肠癌之间的相关性有待进一步观察。2、XRCC1Arg399Gln基因多态性与结直肠癌化疗药物疗效及毒副反应强弱的预测指标之一。