DGAT1酶(酰基辅酶A:二酰基甘氨酸-甘油酰基转移酶)利用酰基-CoA底物催化sn-1,2-二酰基甘油在sn-3位的酰化,是控制脂肪细胞中甘油三酯合成速率的关键酶。甘油三酯是肌内脂肪的主要成分,其含量的提高会促进肌间脂肪的沉积,因此DGAT1可以作为改良家畜肉质性状的备选基因。CRISPR/Cas9技术可以高效的实现基因的敲除或敲入。本研究构建了Rosa26位点定点整DGAT1基因的CRISPR/Cas9打靶载体,采用显微注射法将载体注入小鼠受精卵原核中,生产DGAT1过表达的转基因小鼠。研究结果如下:1.载体的构建本实验利用CRISPR/Cas9系统实现基因的定点敲入,首先构建了sgRNA/Cas9载体以及DGAT1同源重组载体,经过酶切、测序鉴定分析,证实两种载体构建成功。2.载体的功能验证利用电穿孔转染方法将sgRNA/Cas9载体、DGAT1同源重组载体转入C2C12细胞中,提取转染后的细胞基因组并利用PCR鉴定外源基因同源重组的情况,结果证明载体可以成功在预定位点敲入目的基因。3.转基因小鼠的制备与鉴定通过原核注射法将sgRNA/Cas9质粒、DGAT1整合载体共同注入小鼠受精卵的原核中,共注射657枚受精卵,体外培养后获得314枚胚胎,移植后出生33只小鼠,经PCR鉴定,其中2只为阳性小鼠,阳性率为6%。4.转基因小鼠DGAT1基因表达的检测利用实时定量PCR法对两只阳性小鼠肌肉组织进行DGAT1表达水平的检测,发现2号小鼠的DGAT1 mRNA相对表达量是对照小鼠的2.54倍,4号小鼠的DGAT1 mRNA相对表达量是对照小鼠的3.57倍。通过Western Blot检测外源基因的蛋白质表达水平,结果表明2号小鼠的DGAT1蛋白相对表达量是对照小鼠的1.25倍,4号小鼠的DGAT1蛋白相对表达量是对照小鼠的1.43倍。5.阳性小鼠肌肉组织脂肪酸测定选取阳性小鼠腿部肌肉,测定其甘油三酯和脂肪酸的含量,结果发现,肌肉组织中二者的含量与对照组相比都有所增加,证明DGAT1基因过表达在一定水平上增加了小鼠肌内脂肪的沉积。本研究成功制备了DGAT1基因过表达转基因小鼠,该动物模型的建立为优质肉用家畜的育种研究奠定了一定基础。