研究背景:婴幼儿血管瘤(Infantile hemangioma,IH)是婴幼儿最常见的良性肿瘤。新生儿发病率高达10-12%,约60%的病变发生于头颈部,严重者可影响患儿容貌、受累器官功能、心理健康等。若不加以干涉治疗,大多数IH患者在一岁内快速增长,之后在童年时慢慢退化为纤维脂肪组织。但约10%的IH由于其生长过于迅速、面积过大或者生长部位特殊,可能导致毁容、畸形、功能障碍甚至危及生命等。但目前IH特征性增殖、消退机制尚未阐明,致使其临床治疗效果也不甚满意。目前关于IH的发生机制的探讨,主要集中于血管瘤内皮细胞的起源方面,其主要假说有:遗传和基因突变学说、胎盘绒毛膜内皮细胞学说、干细胞学说等,但目前仍未有一种学说能够很好阐明IH早期过度增生与后期自行消退的临床特征。以往认为IH是始动于血管内皮细胞,但2008年Khan等首次报道从IH组织中提取出血管瘤干细胞后,证实IH中存在干细胞。课题组前期研究发现,刚分娩出的婴幼儿若发现存在血管瘤,立即取婴幼儿血管瘤的胎盘组织(IHP),实验发现组织中存在内皮祖细胞,HE染色结果显示,增生期IH与IHP的病理学组织形态相类似,而消退期IH组织中,未见内皮祖细胞的表达。血管内皮祖细胞是干细胞的一种,能够定向分化为血管内皮细胞,同时具有自我更新、无限增殖、多向分化的能力,与增生期血管瘤临床表现相似。综上所述,本课题推测:婴幼儿血管瘤的血管增生,是血管内皮祖细胞通过胎盘组织,动员、迁移、定植并异常聚居于胚胎期的胎儿某个部位,在婴儿出生后,由于胎盘产生的生长抑制因子被解除,在雌激素、各种细胞因子、特别是内环境改变等因素的作用下,选择性激活内皮祖细胞,激活的内皮祖细胞出现增殖,其丝足沿着促血管生长因子分泌充足的地方迁移,形成血管分支,芽生的血管侧枝吻合形成血管丛,导致血管瘤增生期,血管瘤内皮细胞大量增殖、血管快速新生(出生~1岁左右);随后在一系列信号通路的调控下,h EPCs逐渐分化为内皮细胞后其自身表达逐渐减少,IH进入相对静止期(1岁后),之后婴幼儿体内微环境的改变导致血管瘤内皮细胞逐渐被纤维结缔组织及脂肪组织所取代,从而产生特异性的消退期(5~10岁);我们认为这种推测血管瘤的发生、发展、消退符合IH临床表现,解释较为合理。目前认为内皮细胞过度增殖,血管迅速生长是IH病理组织学的最大特点。新生血管的生长和发育是由一系列血管生长因子通过许多信号通路完成的。传统的观点认为血管形成只存在于成体,而血管生成仅限于胚胎。随着h EPCs在成体的分离成功,证明血管生成也发生于成体。因此,血管形成、血管生成可能是人类血管新生的基本过程。h EPCs是内皮细胞的前体细胞,在形态学无法将h EPCs与其他细胞区分开来,所以主要靠分子标志识别。目前共识,CD34、CD133共同标记的即为h EPCs。那么,各种细胞因子、内环境信号改变是如何来调控血管瘤的发生与发展的呢?目前,在其他肿瘤的研究中也发现,血管内皮细胞及间质细胞分泌的促血管生成因子和抑血管生成因子,共同调控血管的发生与血管的形成。血管的新生是由于血管内皮细胞在血管内皮生长因子(VEGF)等许多细胞因子的诱导下,发生迁移和增殖,导致血管大量增生。VEGF是目前发现的最强的促血管生成因子,是新生血管形成过程中的中心调控因子及血管内皮细胞特异性的有丝分裂原,多种肿瘤动物模型研究已证实阻断VEGF信号通路能够降低肿瘤微血管密度,从而抑制肿瘤的生长。有研究显示DLL4/Notch信号通路过度表达,可产生非功能性血管,管腔纤细,血流明显减少,导致肿瘤缺血、缺氧,从而抑制肿瘤增生。VEGF可诱导DLL4表达,激活DLL4/Notch信号通路,提示VEGF对DLL4/Notch信号通路有正调节作用。而此信号通路的活化可减弱内皮细胞对VEGF诱导的血管新生反应,提示其可能会反馈抑制VEGF信号通路的功能活性。因此,只有在VEGF和DLL4/Notch信号通路的协调作用下,血管瘤血管新生才能有序进行。目的为进一步研究证实上述猜想,本研究拟1、在IH不同时期及IHP中,检测CD34/CD133染标记的h EPCs的表达水平,证实增生期及IHP组织中h EPCs呈显著性高表达,而消退期低表达或不表达,从而证实h EPCs与IH的发生发展密切相关,验证我们的推测,胎盘源性h EPCs始动IH的发生发展。2、在IH不同时期,免疫组织化学法检测CD34、CD133、VEGF、DLL4的表达水平,探讨VEGF-DLL4/Notch信号通路参与调控婴幼儿血管瘤的血管新生。方法:1、收集广州医科大学附属第五医院病理科2014-2017年婴幼儿血管瘤存档蜡块50例其中男22例,女28例,年龄1月~2岁、平均1.2岁,患者术前均未做任何辅助性治疗。将所有标本进行常规HE染色,免疫组织化学SP法检测增殖细胞核抗原(PCNA),按Mulliken分类标准并结合PCNA的表达进行分组:石蜡标本中增生期血管瘤26例,消退期血管瘤24例。应用免疫组织化学SP法检测IH增生期、消退期组织中第Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)、VEGF、DLL4及CD34的表达水平。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对VEGF和DLL4的表达进行定量分析,并测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积。为下一步实验提供依据。2、收集广州医科大学附属第五医院妇产科2014-2017年出生后发现疑似血管瘤的新生儿,在产妇胎盘娩出30分钟内,在无菌操作下,切取胎盘叶状绒毛膜部分。取材15例,常规HE染色后,鉴定符合婴幼儿IHP者5例,例其中男3例,女2例,经家属同意后取正常胎盘组织5例,作为阴性对照组。用免疫组化及免疫荧光法鉴定IHP及增生期IH组织中存在h EPCs,同时检测CD34、CD133、DLL4的表达水平。结果:1、通过免疫组化实验结果显示:婴幼儿血管瘤增生期组VEGF、DLL4、CD34的表达明显高于消退期组和正常皮肤组(P<0.05),而后两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。VEGF表达阳性血管瘤的MVD为37.6±1.6,VEGF表达阴性血管瘤的MVD为16.4±2.0,两者差异具有显著性差异(t=4.87,P<0.01)。VEGF和DLL4阳性面积率的相关性分析显示,VEGF和DLL4在增生期及消退期IH组织中的表达均呈正相关,r=0.821,P=0.003;DLL4:r=0.830,P=0.003。在IHP组织中,CD34,CD133以及DLL4主要定位于叶状绒毛膜内侧,阳性结果呈现弥漫分布的棕黄色颗粒,CD34,CD133及DLL4表达显著。CD34,CD133及DLL4阳性率与阴性率相比,差异具有显著性意义(P均<0.01)。免疫荧光法鉴定时,CD34荧光染色时呈绿光,CD133呈红光,双染色显著时呈黄色或黄绿色荧光,核染DAPI呈蓝色,进一步证实上述实验结果。结论:1.CD34、CD133、DLL4及CD34、CD133共同染色标记的内皮祖细胞在婴幼儿血管瘤增生期及IHP组织中高表达,消退期及正常胎盘组织中低表达或不表达,提示内皮祖细胞在婴幼儿的发生发展过程中扮演重要角色。2.VEGF、DLL4、CD34、在婴幼儿血管瘤增生期组织中呈高表达,而在消退期低表达或不表达,并存在显著性差异,提示VEGF-DLL4/Notch信号通路参与调控婴幼儿血管瘤的发生发展。