牛冠状病毒（Bovine Coronavirus，BCoV）属于冠状病毒科，冠状病毒属2a亚群，是引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原。流行病学调查表明，牛冠状病毒在牛场中普遍存在，主要通过消化道和呼吸道传播，感染的牛长期带毒并在一定时期内持续排毒，易造成牛群的大范围感染。因此，对带毒牛的及时检出和牛场环境监测就显得尤为重要。目前国内外尚无针对BCoV感染治疗的特效药物，奶业发达国家应用灭活疫苗或减毒疫苗预防本病，而我国尚无相关商品化疫苗。因此，亟需建立该病毒快速敏感的检测方法，并对我国部分地区奶牛场的BCoV流行情况进行调查，及早发现BCoV感染的牛，掌握流行病学数据，以便及时采取更有效的针对性措施进行防控，以减少该病毒对养牛业造成的经济损失。本研究根据GenBank收录的牛冠状病毒N基因序列，设计合成了1对扩增N基因部分片段的特异性引物，以BCoV病毒的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物纯化回收后送华大基因测序，将测序正确后的N基因片段连接到pEASY-T3载体上，经酶切鉴定、测序验证获得了重组质粒pEASY-T3-N。以得到的重组质粒pEASY-T3-N为阳性标准品，进行一系列稀释，选取6个梯度稀释的标准品作为模板进行荧光定量PCR反应，建立标准曲线和回归方程。然后运用常规PCR和实时荧光定量PCR方法，对2013～2014年本实验室采集的5个规模化奶牛场的212份临床样本进行病原学检测。最后设计合成了1对用于扩增N基因全长的特异性引物，将PCR扩增后产物送测序鉴定，应用DNAstar生物学软件将测得的N基因全长序列与GenBank中的序列进行系统发生分析。序列测定表明，我们克隆获得的100bp大小的片段正确，并且成功获得了重组质粒pEASY-T3-N阳性标准品。在建立的牛冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法中，一个反应体系中模板最低检测限为7.8copies/μL，比普通RT-PCR更加灵敏；熔解曲线只出现特异性的单个峰，而没有明显的引物二聚体或者非特异性扩增的峰出现，证明该方法具有良好的特异性。同时与牛轮状病毒（bovine rotavirus，BRV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛肠道病毒（bovine enterovirus，BEV）、牛流行热病毒（bovine ephemeral fevervirus，BEFV）和牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type3，BPIV-3）均无交叉反应；批内、批间重复变异系数均低于1.5%。因此，该方法敏感性高，特异性强，重复性好，为牛冠状病毒的临床诊断和流行病学调查提供了技术保障。通过对临床样本进行PCR检测发现：在107份鼻拭子样本中，BCoV感染阳性率为5.61%，同时检测到BCoV分别与BVDV、IBRV、BPIV3混合感染阳性率依次为4.60%、4.70%、5.60%；在105份粪便样本中，BCoV感染阳性率33.33%；同时检测到BCoV分别与BVDV、IBRV、BEV混合感染阳性率依次为18.10%、5.71%、29.52%。通过以上调查表明牛冠状病毒在牛场中是普遍存在的，且与其他病原混合感染严重，为牛病防疫带来了重大隐患。通过扩增阳性样本中的BCoV N基因全长序列，测序分析发现，测的的N基因全长序列与GenBank中收录的BCoV N基因差异不大，为疫苗研制提供指导。