论文部分内容阅读
动物低氧耐受研究集中于氧气运输和能量代谢两个方面。大量低氧胁迫下能量代谢研究涉及糖代谢,脂代谢研究在近15年才成为人们关注焦点。脂类可用于氧化产能、膜合成、贮能以及合成信号分子等方面,对细胞存活和增殖至关重要。有研究表明,动物在低氧条件下会产生血脂异常、脂代谢紊乱等脂代谢疾病。作为营地下生活的甘肃鼢鼠（Eospalax cansus）常年生活在低氧环境但未出现脂代谢紊乱,是理想的低氧适应模型生物。通过研究甘肃鼢鼠肝脏低氧脂代谢及其调控,可拓宽地下鼠低氧耐受脂代谢的研究视野,充实和丰富低氧耐受机制研究基础,并可为脂代谢紊乱等相关疾病的治疗提供新思路。为揭示甘肃鼢鼠在低氧胁迫下,肝脏胆固醇（CHO）和脂肪酸（FA）代谢的调控机制,本研究以成年健康甘肃鼢鼠和SD大鼠为研究对象,每种鼠类随机选择18只,各分为3组（n=6只）。分别耐受常氧（21%O2,7d）、慢性低氧（10.5%O2,44 h）和急性低氧（6.5%O2,6 h）3种条件处理。对甘肃鼢鼠常氧组和急性低氧组转录组数据做差异基因通路分析,筛选低氧胁迫下脂代谢相关通路与基因;通过实时定量PCR对低密度脂蛋白受体（Ldlr）、前蛋白转化酶枯草溶菌素9（Psck9）、B类Ⅰ型清道夫受体（Scarb1）、胆固醇7α-羟化酶（Cyp7a1）、低密度脂蛋白受体相关蛋白5（Lrp5）、低密度脂蛋白受体相关蛋白6（Lrp6）、低氧诱导因子（Hif-1）、脂肪酸合成酶（Fasn）、乙酰辅酶A羧化酶（Acc1）和心形脂肪酸结合蛋白（Fabp3）的转录水平,通过Weston Blot对LDLR、SCARBl、CYP7A1、LRP5、LRP6、FASN和FABP3的翻译水平研究甘肃鼢鼠肝脏低氧胁迫对胆固醇和脂肪酸的调控;通过生物化学方法研究低氧胁迫下血液低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、总胆固醇（CHOL）和甘油三酯（TG）含量变化;通过免疫组化研究蛋白质（LDLR、SCARB1、CYP7A1、LRP5、LRP6、FASN和FABP3）在肝脏分布特点:通过油红O染色测定肝脏内甘油三酯含量。最后搭建了脂代谢相关基因生物信息学分析导航站并编写爬虫,实现对脂代谢相关基因自动化分析。基于以上方法技术,系统研究甘肃鼢鼠肝脏在低氧胁迫下对胆固醇和脂肪酸代谢的调控,主要研究结果如下:1.甘肃鼢鼠急性低氧组与常氧组间有270条通路出现差异表达基因,其中有17条通路直接参与脂类合成和转运。2.甘肃鼢鼠常氧和低氧条件下血脂变化:甘肃鼢鼠在常氧及低氧条件下,血液中LDL-C、HDL-C、总胆固醇含量不同程度高于SD大鼠,存在高脂血现象,慢性低氧条件下最明显,甘肃鼢鼠LDL-C、HDL-C和总胆固醇含量分别是SD大鼠的7.19倍、3.92倍和5.22倍。甘肃鼢鼠在慢性低氧条件下:LDL-C和总胆固醇显著升高,分别为常氧组的8.44倍和2.70倍,HDL-C浓度升高,为常氧组1.86倍,但无显著性差异（p=0.11）。3.甘肃鼢鼠脂代谢调节基因表达:1)胆固醇转运和降解慢性低氧条件下:甘肃鼢鼠Ldlr和Psck转录水平表达量无显著变化,LDLR翻译水平表达量上调,为常氧组的1.28倍,表明肝对LDL-C回收增加。Scarbl转录水平和翻译水平均未检测到表达,表明肝回收HDL-C能力大幅减弱。Cyp7a1转录水平和翻译水平表达量显著下调,分别为常氧组的0.15倍和0.37倍,表明胆固醇降解减弱。急性低氧条件下:甘肃鼢鼠Ldlr、Psck9转录水平表达量同步下调,分别为常氧组的0.70倍和0.21倍,Scarb1和Cyp7a1转录水平表达量上调,分别为常氧组的1.49倍和2.20倍。LDLR和SCARB1翻译水平表达量均无显著变化,CYP7A1翻译水平表达量下调,为常氧组的0.63倍,表明胆固醇降解减弱。SD大鼠低氧条件下,LDLR翻译水平表达量均上调。慢性低氧条件下,SCARB1翻译水平表达量下调,为常氧组的0.52倍,表明LDL-C回收增强,HDL-C回收减弱;急性低氧条件下,SCARB1、CYP7A1翻译水平表达均上调,分别为常氧组的1.38倍和1.30倍,表明LDL-C、HDL-C回收增强,并增强胆固醇降解。2)Wnt通路对胆固醇的转运慢性低氧条件下:甘肃鼢鼠Lrp5转录水平表达量下调但无显著性,Lrp6转录水平表达量上调,为常氧组的2.42倍。LRP5翻译水平表达量下调,为常氧组的0.72倍,LRP6翻译水平表达无变化,表明对LDL-C摄取总体下降,无Wnt通路异常代谢迹象。急性低氧条件下:甘肃鼢鼠Lrp5转录水平表达量下调,为常氧组的0.35倍,Lrp6转录水平表达量无显著变化,LRP5翻译水平表达量下调,为常氧组的0.72倍,LRP6翻译水平表达量无变化,减少对血液LDL-C摄取,无Wnt通路异常代谢迹象。SD大鼠Lrp5、Lrp6在慢性低氧和急性低氧条件下转录水平表达量均呈现不同程度升高,增加对血液LDL-C摄取,增高Wnt通路表达。3)脂肪酸合成与转运慢性低氧条件下:甘肃鼢鼠Accl转录水平表达量下调,为常氧组的0.47倍。FASN翻译水平表达量下调,为常氧组的0.19倍,表明合成脂肪酸能力下降。FABP3翻译水平表达量上调,为常氧组的1.54倍,表明转运脂肪酸能力上升。急性低氧条件下:甘肃鼢鼠Accl和Fasn转录水平表达量显著下调,分别为常氧组的0.30倍和0.44倍,Fabp3转录水平表达量显著上调,为常氧组的5.24倍。FASN翻译水平表达量下调,为常氧组的0.19倍。FABP3翻译水平表达趋势与转录水平相反,呈现下调,为常氧组的0.63倍,合成和转运脂肪酸能力均下降。SD大鼠在低氧条件下Acc1和Fasn在转录水平均显著上调,整体表现为增加脂肪酸合成。油红O染色显示,甘肃鼢鼠和SD大鼠肝脏在低氧条件下均无脂滴堆积。4.甘肃鼢鼠脂代谢调节基因蛋白质定位甘肃鼢鼠与SD大鼠中蛋白质定位基本一致,LDLR、SCARB1、LRP5、LRP6、FABP3等转运蛋白在血管内皮细胞分布较多,其中SCARB1、LRP5和FABP3在细胞质也有分布。CYP7A1和FASN为细胞质分布。5.利用开源软件Typecho搭建脂代谢相关基因生物信息学分析导航站,利用Python编写网络爬虫软件,实现脂代谢相关基因生物信息学分析自动化。该导航站与网络爬虫同时适用其它基因研究。基于上述研究结果,本研究主要结论为:1.甘肃鼢鼠对低氧胁迫的应对积极而广泛,急性低氧组与常氧组间有270条通路有基因富集,有17条通路直接参与脂类合成和转运。2.甘肃鼢鼠在常氧及低氧条件下,血液中LDL-C、HDL-C和总胆固醇浓度均不同程度高于SD大鼠,表现出高脂血特点。甘肃鼢鼠肝脏主要在慢性低氧条件调控血液胆固醇,通过下调SCARBl表达,降低肝脏HDL脂类回收,间接促进HDL-C转移至LDL增高LDL-C;通过下调CYP7A1,降低胆固醇降解。通过减少HDL-C回收、降低胆固醇降解,从而升高血液LDL-C和总胆固醇,推测甘肃鼢鼠存在以高脂血应对低氧胁迫的低氧适应。3.在慢性和急性低氧条件下,甘肃鼢鼠下调LRP5降低血液胆固醇摄取,避免Wnt信号通路异常激活,避免增高癌变风险。SD大鼠低氧条件下上调Lrp5和Lrp6增大癌变风险。4.在低氧胁迫下,甘肃鼢鼠下调Accl和Fasn降低肝脏脂肪酸合成。慢性低氧上调FABP3表达,加强血液脂肪酸摄取;急性低氧下调FABP3表达,减少血液脂肪酸摄取。研究甘肃鼢鼠应对高脂血带来的不利影响和低氧脂代谢应答机制,有助于我们更好地了解低氧脂代谢,并可为脂代谢类疾病和高脂血患者的治疗提供新思路。