脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是骨科领域致残率、死亡率最高的创伤之一,是交通、工矿事故及运动意外中常见的损伤。近年来,神经干细胞(neural stem cell, NSC)移植成为SCI截瘫治疗的研究焦点之一。但最近国外有研究表明,将体外悬浮方式培养的大鼠胚胎NSC移植入成鼠损伤脊髓后,移植细胞只能分化成星形胶质细胞;并认为这是由于宿主损伤脊髓内环境不支持NSC向神经元祖细胞分化所致,但损伤脊髓却允许谱系限制性的神经元前体细胞(neuronal-restricted precursor cell, NRP)和胶质前体细胞(glial-restricted precursor cell,GRP)的存活及分化。贴壁方式培养的神经前体细胞主要由NRP/GRP组成,于是贴壁培养手段重新受到国外一些学者的重视。然而,究竟何种类型细胞更适于SCI移植治疗,目前尚无定论。本实验比较了神经前体细胞在悬浮与贴壁两种培养方式下的生长特性,旨在为选择合适类型的细胞移植治疗SCI提供参考依据。SCI包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤为不可逆性改变,故治疗主要针对继发性损伤。研究已发现由氧自由基介导的脂质过氧化反应对脊髓继发性损伤起主要作用。脂质过氧化损伤的程度对移植细胞的命运影响也很大。祖国医学将SCI所致的截瘫,归属于体惰和痿证的范畴,治疗上以活血化瘀、疏通督脉、通经活络、益气补血、补肾填精为主。肾主骨生精髓,精髓伤则肾伤,精血互生,且肾所生精髓需靠后天之本、气血化生之源的脾胃源源不断地充盈。滋补脾阴方药(nourishing piyin remedy)具有益气补血、补肾填精、充盈脾胃等功效,可以改善脊髓细胞线粒体ATP酶活性,缓解脂质过氧化反应;并能通过调节磷脂代谢,增强线粒体膜抗氧化能力以保护脑神经细胞。本实验探讨了滋补脾阴方药含药血清对NRP/GRP细胞脂质过氧化损伤的保护作用及机制,旨在为进一步联合应用含药血清和NRP/GRP细胞移植治疗SCI奠定基础。目前在SCI模型建立方面,国内外以Allen装置或NYU装置打击的轻度挫伤模型(致伤力2.5g×10cm)应用较为广泛。中度挫伤模型(致伤力5g×10cm)涉及很少。轻度脊髓挫伤后,早期的组织缺失及后期的继发损伤均较轻。而中度挫伤在形态学及病理生理学上的损伤均较重,移植物的生存环境更差,其中过氧化损伤作用尤为明显。因此,本实验利用滋补脾阴方药含药血清的抗过氧化损伤作用,预先保护移植NRP/GRP细胞,以探讨二者联合应用对脊髓中度挫伤的神经修复作用。实验一胚胎脊髓源神经前体细胞悬浮与贴壁培养的生长特性研究目的:比较胚胎脊髓源神经前体细胞在悬浮与贴壁两种培养方式下的生长特性,为选择合适类型的细胞移植治疗脊髓损伤提供参考依据。方法:取孕13.5天的SD大鼠胚胎脊髓组织,按悬浮和贴壁两种方式分组培养神经前体细胞。观察细胞生长形态学变化。描绘细胞生长曲线。培养72小时后行BrdU增殖率检测,Nestin、PSA-NCAM、A2B5抗体荧光鉴定和流式细胞检测。部分细胞行胎牛血清诱导分化试验。结果:悬浮组细胞多以细胞球形态生长,贴壁组细胞呈散在生长。悬浮组细胞生长状态更旺盛。培养72小时悬浮和贴壁组细胞的BrdU增殖率分别为28.50%±4.67%和9.11%±1.82%(P<0.05);两组细胞Nestin、NCAM、A2B5抗体荧光反应均呈阳性;悬浮组各抗体表达率相对较均匀,而贴壁组以NCAM、A2B5抗体表达为主(>80%)。两组细胞经胎牛血清诱导,均能逐渐分化成熟,表达NF-200,GFAP,Gal-C荧光抗体。结论:悬浮组细胞增殖能力强于贴壁组。早期悬浮培养细胞以神经干细胞和祖细胞为主;而贴壁培养细胞则以谱系限制性神经前体细胞为主(>80%)。悬浮及贴壁组细胞经胎牛血清诱导,均可分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。实验二滋补脾阴方药保护谱系限制性神经前体细胞抗脂质过氧化损伤的研究目的:探讨滋补脾阴方药含药血清对谱系限制性神经前体细胞脂质过氧化损伤的保护作用,为进一步体内移植实验治疗脊髓损伤奠定基础。方法:取贴壁培养3天的谱系限制性神经前体细胞,分正常组、损伤组、空白血清干预组、中药血清干预组、空白血清干预后损伤组和中药血清干预后损伤组,建立过氧化氢损伤模型。观察细胞形态学变化;利用MTT法计算细胞存活率;检测细胞内MDA含量和SOD活力;并行Hoechst33258荧光染色,观察细胞荧光分布和凋亡情况。结果:过氧化氢损伤可造成细胞存活率显著降低;细胞内MDA含量明显增加,SOD活力明显下降;并加快细胞凋亡。经含药血清干预后的细胞在同样损伤条件下,细胞存活率提高;并避免了细胞内MDA含量的过度增加,和SOD活力的过度下降;还能减轻细胞凋亡。结论:滋补脾阴方药含药血清对谱系限制性神经前体细胞脂质过氧化损伤起一定程度的保护作用;并能改善过氧化损伤后细胞的存活率和存活状态。实验三滋补脾阴方药保护谱系限制性神经前体细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究目的:探讨谱系限制性神经前体细胞(NRP/GRP)移植对脊髓中度挫伤的神经修复作用,及滋补脾阴方药含药血清对移植细胞在体内存活、迁移和分化的影响。方法:成年雌性SD大鼠60只,随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)、DMEM培养基移植组(C组)、NRP/GRP移植组(D组)、NRP/GRP与空白血清共移植组(E组),和NRP/GRP与中药血清共移植组(F组)。利用自制电控打击器制作动物模型。通过BBB评分、皮层体感诱发电位测定,评价运动、感觉功能恢复情况。术后4天、2周和5周时,分别观察BrdU标记的移植细胞在体内的存活、迁移和分化情况。结果:F组在术后2周,BBB评分明显恢复。D组、E组在术后4周,BBB评分明显恢复。术后5周F组CSEP波形略恢复。术后4天、2周和5周时,细胞移植三组分别可见较多的BrdU标记细胞在体内存活、迁移和分化,均以F组最明显。结论:谱系限制性神经前体细胞移植后,可以在体内存活、迁移并分化成熟,促进大鼠脊髓中度挫伤后神经纤维的修复与再生。滋补脾阴方药含药血清可以改善损伤脊髓内环境,有利于移植细胞的存活、迁移及分化。二者联合应用具有协同效应。综上所述,本实验通过对滋补脾阴方药保护谱系限制性神经前体细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究,获得了以下成果:1.早期悬浮培养细胞是以神经干细胞和神经祖细胞为主的混合物;而贴壁培养细胞则以谱系限制性神经前体细胞为主(>80%)。悬浮及贴壁培养细胞经胎牛血清诱导,均可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。2.滋补脾阴方药含药血清通过避免细胞过氧化损伤后SOD过度下降,减少损伤后MDA生成,对谱系限制性神经前体细胞脂质过氧化损伤起一定程度的保护作用。3.谱系限制性神经前体细胞在脊髓中度挫伤后即刻移植,可以在体内存活、迁移并分化为成熟的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞,从而促进大鼠脊髓损伤后神经纤维的修复与再生;是治疗脊髓损伤较有前景的细胞移植物。4.滋补脾阴方药含药血清可以改善损伤脊髓的内环境,减轻移植细胞的过氧化损伤反应,有利于移植谱系限制性神经前体细胞在体内的存活、迁移和分化。滋补脾阴方药含药血清与谱系限制性神经前体细胞移植联合应用治疗脊髓损伤,具有协同效应。5.如何进一步增强谱系限制性神经前体细胞的增殖能力,增强滋补脾阴方药含药血清的抗氧化损伤作用,还有待今后的实验研究与完善。谱系限制性神经前体细胞与组织工程支架的联合应用,与基因转染技术的联合应用方面还有广阔的研究空间,待广大学者研究探讨。