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感音神经性听力损失（sensorineural hearing loss, SNHL）是临床最常见的感觉障碍，是由毛细胞及相连的螺旋神经节细胞受损引发的。在哺乳动物出生后，毛细胞的损伤或丢失是永久性的，因为内耳耳蜗内没有毛细胞的再生发生。近年来，干细胞替代治疗技术的日益发展给感音神经性听力损失的治疗和康复带来曙光。然而，成功再生毛细胞是一项艰巨的挑战，如何获得足够的细胞源、如何提高毛细胞分化效率、如何控制移植细胞的迁移、存活和功能状态等问题亟需解决。以往研究表明，组织工程技术可能是一个好的选择来解决上面提到的诸多问题，而利用组织工程方法促进干细胞的增殖和分化将是未来听觉再生研究领域的一个重要方向。
电纺丝是目前制备纳米级纤维支架最简便有效的方法。左旋聚乳酸（Poly L-lactic acid，PLLA）是纳米纤维支架最常见的制备材料。研究表明，胶原蛋白是构成听觉基底膜的重要成分，具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性。明胶（Gelatin）是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，与胶原具有同源性，具有优良的亲水性和生物相容性，作为胶原的替代物在组织工程领域有着广泛应用。因而，为了更好的模拟内耳微环境，达到诱导听觉细胞再生的目的，本研究将PLLA和明胶共纺制备复合纳米纤维膜（PLLA/Gelatin）。然而，以往研究表明，简单的复合材料不能完全模拟体内的组织微环境，越来越多的研究致力于将生物活性更好的成分引入复合支架中以提高其仿生性能。
有研究表明，鸡胚椭圆囊基质细胞（utricle stromal cell）可以通过共培养体系有效地诱导干细胞向毛细胞的分化。然而，鸡胚椭圆囊基质细胞与小鼠内耳干细胞共培养存在着很多的种属间污染风险。到目前为止，还没有研究报道鸡胚椭圆囊基质细胞来源的ECM （U-ECM）对干细胞分化的影响。从理论上讲，鸡胚椭圆囊基质细胞来源的ECM既可以去除细胞结构和降低其免疫原性，又保留了鸡胚基质细胞分泌的活性成分，具有较高的生物活性，适于毛细胞再生的研究和应用。 因此，经过鸡胚椭圆囊基质细胞的ECM改性的PLLA/Gelatin仿生纳米纤维支架（U-ECM/PLLA/Gelatin）有望促进干细胞向毛细胞分化。
最近，人们越来越关注利用自身内耳干细胞来诱导听觉毛细胞再生。内耳干细胞是一类来自内耳听觉上皮的具有自我更新能力干细胞，通过特定的诱导培养，不仅可以分化为毛细胞、还可以分化为支持细胞和神经元细胞，内耳干细胞是研究听觉细胞再生的一类理想细胞源。不幸的是，哺乳动物听觉上皮中的内耳干细胞数量有限，且随出生后年龄的增长内耳干细胞逐渐丧失，严重阻碍了这类干细胞的研究和应用。以往研究证实，来自小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts, MEF）可以提供特异的微环境以促进多能干细胞增殖和扩增。然而，MEF或MEF衍生的ECM是对内耳干细胞增殖的作用，是否能进一步扩增内耳干细胞的研究尚未有报道。
本研究的主要目的是构建内耳发育微环境诱导干细胞分化为毛细胞:（1）通过电纺丝技术制备不同比例的PLLA/Gelatin纳米纤维膜，结构上模拟天然耳蜗感觉上皮，研究其对听觉细胞分化的影响。（2）分离和培养胚胎期17天鸡胚椭圆囊基质细胞，在PLLA/Gelatin上接种鸡胚椭圆囊基质细胞，然后脱细胞处理，获得鸡胚椭圆囊基质细胞包 被 的 PLLA/Gelatin 生 物 活 性 纳 米 纤 维 支 架（U-ECM/PLLA/Gelatin）。（3）利用小鼠胚胎成纤维细胞来源的细胞外基质(ECM)扩增内耳干细胞。（ 4 ）研究生物模拟复合材料U-ECM/PLLA/Gelatin 纳米支架能否诱导内耳干细胞体外分化。
首先，分别通过电纺技术制备了不同比例 PLLA/Gelatin 的共轭非取向纳米纤维膜支架，然后通过对 PLLA/Gelatin 共混的非取向纳米纤维膜进行一系列性能表征，结果发现本研究制备的共轭无取向混纺支架其纤维形貌良好，化学结构明确；其次，通过对复合支架在直径分布、热重分析、亲水性，力学性能和细胞相容性评价等测试结果的综合分析，发现PLLA/Gelatin=50/50比例的共混组效果最优，因此在本研究中选择该组为基础支架材料。
其次，我们从孵育17 d的鸡胚中提取并分离纯化获得了高活性的鸡胚椭圆囊基质细胞，通过选用P5代的鸡胚椭圆囊基质细胞种植于 PLLA/Gelatin 共混复合纳米纤维支架上进行培养，并用 20 mM NH4OH & 0.3% Triton X-100 制备了U-ECM/PLLA/Gelatin 仿生支架。通过使用 CCK-8 法、细胞免疫荧光染色和扫描电镜等检测负载鸡胚基质细胞外基质的纳米支架复合体其组成、细胞相容性以及表面形貌等指标。结果表明，通过改良已有的脱细胞方法，利用物理化学法对负载鸡胚椭圆囊基质细胞的 PLLA/Gelatin=50/50 纳米支架去细胞处理后，发现复合支架黏附有各种 U-ECM（支架上保留了纤维连接蛋白、层粘连蛋白、弹力蛋白等）主要成分蛋白，整个优化后的脱细胞处理过程对U-ECM成分未造成不良影响，细胞毒性实验与CCK8检测的生物相容性结果均显示复合支架U-ECM/PLLA/Gelatin对内耳干细胞增殖起到明显促进作用。
第三，从小鼠胚胎成纤维细胞分离培养MEF细胞，并制备MEF细胞外基质（MEF-ECM）。接着对小鼠耳蜗内耳干细胞在MEF-ECM上的自我更新能力进行评价。扫描电镜下，在脱细胞的MEF中可以清楚的识别出MEF-ECM，免疫荧光染色结果显示，该ECM由I型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白组成。最重要的是，与培养板上（TCP）生长的细胞相比，MEF-ECM能有效促进内耳干细胞的增殖，且内耳干细胞培养到 P8 代后仍具有良好的自我更新能力。RT-PCR结果显示，内耳干细胞扩增后仍能表达多能干细胞相关基因（nestin和sox2）。这些结果表明MEF脱细胞基质的微环境可能参与了内耳干细胞干性的维持。上述方法扩增获得的内耳干细胞可以作为本研究后续实验的干细胞源。
最后，我们在 U-ECM/PLLA/Gelatin 复合支架上接种内耳干细胞，研究仿生听觉上皮结构和活性成分的综合微环境对干细胞向毛细胞分化的影响。实验发现，细胞在支架上分化7天后，RT-PCR分别检测出听觉毛细胞相关基因（myosin VIIA and espin），听觉支持细胞标志基因P27kip1和内耳螺旋神经节神经标志基因TUJ1的表达。免疫荧光法检测毛细胞标志物（Myosin VIIA and Espin）以及支持细胞标志物P27kip1的表达。实验结果表明，U-ECM/PLLA/Gelatin复合支架可诱导内耳干细胞向毛细胞和支持细胞分化。
综上所述，本研究通过电纺丝制备了PLLA/Gelatin复合纳米纤维膜，并负载具有高生物活性的鸡胚椭圆囊基质细胞的ECM从而设计出一类新型的仿生支架。实验结果表明， U-ECM/PLLA/Gelatin复合仿生支架能够促进内耳干细胞向毛细胞分化。此外，本研究结果表明MEF-ECM能有效促进内耳干细胞的增殖，将为促进细胞治疗听力损失提供一种有价值的研究方法。
电纺丝是目前制备纳米级纤维支架最简便有效的方法。左旋聚乳酸（Poly L-lactic acid，PLLA）是纳米纤维支架最常见的制备材料。研究表明，胶原蛋白是构成听觉基底膜的重要成分，具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性。明胶（Gelatin）是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，与胶原具有同源性，具有优良的亲水性和生物相容性，作为胶原的替代物在组织工程领域有着广泛应用。因而，为了更好的模拟内耳微环境，达到诱导听觉细胞再生的目的，本研究将PLLA和明胶共纺制备复合纳米纤维膜（PLLA/Gelatin）。然而，以往研究表明，简单的复合材料不能完全模拟体内的组织微环境，越来越多的研究致力于将生物活性更好的成分引入复合支架中以提高其仿生性能。
有研究表明，鸡胚椭圆囊基质细胞（utricle stromal cell）可以通过共培养体系有效地诱导干细胞向毛细胞的分化。然而，鸡胚椭圆囊基质细胞与小鼠内耳干细胞共培养存在着很多的种属间污染风险。到目前为止，还没有研究报道鸡胚椭圆囊基质细胞来源的ECM （U-ECM）对干细胞分化的影响。从理论上讲，鸡胚椭圆囊基质细胞来源的ECM既可以去除细胞结构和降低其免疫原性，又保留了鸡胚基质细胞分泌的活性成分，具有较高的生物活性，适于毛细胞再生的研究和应用。 因此，经过鸡胚椭圆囊基质细胞的ECM改性的PLLA/Gelatin仿生纳米纤维支架（U-ECM/PLLA/Gelatin）有望促进干细胞向毛细胞分化。
最近，人们越来越关注利用自身内耳干细胞来诱导听觉毛细胞再生。内耳干细胞是一类来自内耳听觉上皮的具有自我更新能力干细胞，通过特定的诱导培养，不仅可以分化为毛细胞、还可以分化为支持细胞和神经元细胞，内耳干细胞是研究听觉细胞再生的一类理想细胞源。不幸的是，哺乳动物听觉上皮中的内耳干细胞数量有限，且随出生后年龄的增长内耳干细胞逐渐丧失，严重阻碍了这类干细胞的研究和应用。以往研究证实，来自小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts, MEF）可以提供特异的微环境以促进多能干细胞增殖和扩增。然而，MEF或MEF衍生的ECM是对内耳干细胞增殖的作用，是否能进一步扩增内耳干细胞的研究尚未有报道。
本研究的主要目的是构建内耳发育微环境诱导干细胞分化为毛细胞:（1）通过电纺丝技术制备不同比例的PLLA/Gelatin纳米纤维膜，结构上模拟天然耳蜗感觉上皮，研究其对听觉细胞分化的影响。（2）分离和培养胚胎期17天鸡胚椭圆囊基质细胞，在PLLA/Gelatin上接种鸡胚椭圆囊基质细胞，然后脱细胞处理，获得鸡胚椭圆囊基质细胞包 被 的 PLLA/Gelatin 生 物 活 性 纳 米 纤 维 支 架（U-ECM/PLLA/Gelatin）。（3）利用小鼠胚胎成纤维细胞来源的细胞外基质(ECM)扩增内耳干细胞。（ 4 ）研究生物模拟复合材料U-ECM/PLLA/Gelatin 纳米支架能否诱导内耳干细胞体外分化。
首先，分别通过电纺技术制备了不同比例 PLLA/Gelatin 的共轭非取向纳米纤维膜支架，然后通过对 PLLA/Gelatin 共混的非取向纳米纤维膜进行一系列性能表征，结果发现本研究制备的共轭无取向混纺支架其纤维形貌良好，化学结构明确；其次，通过对复合支架在直径分布、热重分析、亲水性，力学性能和细胞相容性评价等测试结果的综合分析，发现PLLA/Gelatin=50/50比例的共混组效果最优，因此在本研究中选择该组为基础支架材料。
其次，我们从孵育17 d的鸡胚中提取并分离纯化获得了高活性的鸡胚椭圆囊基质细胞，通过选用P5代的鸡胚椭圆囊基质细胞种植于 PLLA/Gelatin 共混复合纳米纤维支架上进行培养，并用 20 mM NH4OH & 0.3% Triton X-100 制备了U-ECM/PLLA/Gelatin 仿生支架。通过使用 CCK-8 法、细胞免疫荧光染色和扫描电镜等检测负载鸡胚基质细胞外基质的纳米支架复合体其组成、细胞相容性以及表面形貌等指标。结果表明，通过改良已有的脱细胞方法，利用物理化学法对负载鸡胚椭圆囊基质细胞的 PLLA/Gelatin=50/50 纳米支架去细胞处理后，发现复合支架黏附有各种 U-ECM（支架上保留了纤维连接蛋白、层粘连蛋白、弹力蛋白等）主要成分蛋白，整个优化后的脱细胞处理过程对U-ECM成分未造成不良影响，细胞毒性实验与CCK8检测的生物相容性结果均显示复合支架U-ECM/PLLA/Gelatin对内耳干细胞增殖起到明显促进作用。
第三，从小鼠胚胎成纤维细胞分离培养MEF细胞，并制备MEF细胞外基质（MEF-ECM）。接着对小鼠耳蜗内耳干细胞在MEF-ECM上的自我更新能力进行评价。扫描电镜下，在脱细胞的MEF中可以清楚的识别出MEF-ECM，免疫荧光染色结果显示，该ECM由I型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白组成。最重要的是，与培养板上（TCP）生长的细胞相比，MEF-ECM能有效促进内耳干细胞的增殖，且内耳干细胞培养到 P8 代后仍具有良好的自我更新能力。RT-PCR结果显示，内耳干细胞扩增后仍能表达多能干细胞相关基因（nestin和sox2）。这些结果表明MEF脱细胞基质的微环境可能参与了内耳干细胞干性的维持。上述方法扩增获得的内耳干细胞可以作为本研究后续实验的干细胞源。
最后，我们在 U-ECM/PLLA/Gelatin 复合支架上接种内耳干细胞，研究仿生听觉上皮结构和活性成分的综合微环境对干细胞向毛细胞分化的影响。实验发现，细胞在支架上分化7天后，RT-PCR分别检测出听觉毛细胞相关基因（myosin VIIA and espin），听觉支持细胞标志基因P27kip1和内耳螺旋神经节神经标志基因TUJ1的表达。免疫荧光法检测毛细胞标志物（Myosin VIIA and Espin）以及支持细胞标志物P27kip1的表达。实验结果表明，U-ECM/PLLA/Gelatin复合支架可诱导内耳干细胞向毛细胞和支持细胞分化。
综上所述，本研究通过电纺丝制备了PLLA/Gelatin复合纳米纤维膜，并负载具有高生物活性的鸡胚椭圆囊基质细胞的ECM从而设计出一类新型的仿生支架。实验结果表明， U-ECM/PLLA/Gelatin复合仿生支架能够促进内耳干细胞向毛细胞分化。此外，本研究结果表明MEF-ECM能有效促进内耳干细胞的增殖，将为促进细胞治疗听力损失提供一种有价值的研究方法。