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缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)是我国重要的滩涂经济贝类,与牡蛎、蛤仔、泥蚶一起号称我国“四大养殖贝类”。但是近年来,缢蛏病害经常出现,大批死亡现象时有发生,提高缢蛏抗病能力是减少缢蛏病害发生的重要途径。本研究构建和分析了缢蛏肝胰脏cDNA文库,筛选了免疫相关基因,应用RACE技术以及长PCR技术获得了免疫相关基因cDNA和DNA全长,利用实时荧光定量PCR技术分析了基因的组织表达以及细菌诱导后的时间表达,以期获得缢蛏的免疫候选基因,为缢蛏抗病新药开发、抗病新品种选育等工作奠定基础。1.采用DNS酶均一化处理技术,构建缢蛏肝胰脏cDNA文库,共获得5296个ESTs序列,经拼接后获得了4013个单一基因(Unigene),其中包括540个重叠群(Contig)和3473个单一序列(Singleton)。通过BLAST分析,79.3%序列为未知基因,20.7%序列为已知功能基因,其中43条序列是免疫相关基因。根据其功能,这些免疫相关基因可被分为5类,即20个蛋白酶和蛋白酶调节子基因、6个粘着蛋白基因、3个压力蛋白基因、3个抗菌肽基因、6个溶酶体酶基因和5个信号转导基因。2.从文库中筛选出2条β-actin同源序列,分别命名为β-ACTIN 1和β-ACTIN 2,cDNA全长分别为1552 bp和1454 bp,均含有1131 bp的开放阅读框,同时通过同源克隆技术获得缢蛏18S rRNA基因。比较分析了18S rRNA,β-ACTIN 1和β-ACTIN 2基因的组织表达(水管、鳃、斧足、外套膜、肝胰脏和性腺)稳定性,发现18S rRNA基因最稳定,适合作为内参基因。以18S rRNA基因为内参基因,组织表达及鳗弧菌诱导后的时间表达分析结果显示,2个β-actin基因的表达出现了显著变化,表明2个β-actin基因不适合作为内参基因。3.从文库中获得2条与C型凝集素同源序列,cDNA全长分别为644 bp和1659 bp,分别命名为ScCTL-1和ScCTL-2。ScCTL-1为标准长型C型凝集素,ScCTL-2为紧凑型C型凝集素,二者均具有1个糖识别结构域(CRD)。荧光定量PCR检测结果显示,经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,缢蛏ScCTL-1和ScCTL-2 mRNA在不同组织中的时间表达谱变化趋势不同,表明2个C型凝集素具有不同的功能。4.从文库中筛选出一条与半乳糖凝集素(Galectins)同源序列,cDNA全长为1278 bp,具有识别半乳糖凝集素的特异性序列(H-NRP, WG-EE),命名为Sc-Galectin。预测蛋白包含2个串联的CRDs蛋白结构域,是一个串联重复型半乳糖凝集素。组织表达结果表明,Sc-Galectin mRNA在肝胰脏的表达量显著高于其他组织。经鳗弧菌处理8 h和48 h后,在6个组织中,缢蛏Sc-Galectin mRNA的表达均显著上调,经副溶血弧菌和鳗弧菌分别处理72 h和20 h后,在6个组织中,缢蛏Sc-Galectin mRNA的表达均显著下调并达到最大值。5.从文库中筛选出一条补体(Clq)同源序列,cDNA全长为712 bp,命名为ScC1q。预测蛋白包含一个18个氨基酸的信号肽和一个136个氨基酸的C1q结构域。组织表达结果表明,ScC1q mRNA在肝胰脏的表达量显著高于其他组织。经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,缢蛏ScC1q mRNA在6个组织中的表达水平均出现显著上调和下调,其中在水管、鳃、斧足、外套膜和性腺中的表达变化的趋势比较明显。6.从文库中筛选出一条铁蛋白(ferritin)同源序列,cDNA全长为1106 bp,命名为ScFERs。预测蛋白包含一个高度保守的铁氧化活性中心结构域,该结构域由7个与脊椎动物H型铁蛋白完全一致的氨基酸残基组成,但是在5′非编码区缺失铁调节区域(IRE)。组织表达结果表明,ScFERs mRNA在肝胰脏的表达量显著高于其他组织。经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,ScFERs mRNA在6个组织中的表达水平均出现显著上调和下调,其中在外套膜、斧足和性腺中的表达变化的趋势比较明显。7.从文库中筛选出一条热休克蛋白70(HSP70)同源序列,cDNA全长为2335 bp,是细胞质中的结构型HSC70亚家族基因成员,被命名为Sc-Hsc70。组织表达分析结果显示,ScHsc70 mRNA在外套膜中的表达量最低,而在水管中的表达量最高。经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,ScHsc70 mRNA在缢蛏肝胰脏组织的表达水平呈上调趋势,且分别在20 h和30 h后达到最大。结果表明缢蛏ScHsc70基因可能在介导细菌诱导引起的免疫应答中起到重要作用。8.从文库中筛选出一条小热休克蛋白(sHSP)同源序列,cDNA全长为1220 bp,该基因的氨基酸序列具有典型的小热休克蛋白家族的特征结构:α-晶体蛋白(α-crystallin)结构域,被命名为Sc-sHSP。组织表达结果表明,Sc-sHSP mRNA在肝胰脏的表达量显著高于其他组织。经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,Sc-sHSP mRNA在肝胰脏组织的表达水平呈上调趋势,且均在20 h后达到最大,结果表明Sc-sHSP基因可能在介导细菌诱导引起的免疫应答中起到重要作用。