狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患传染病,人与所有的温血动物都易感并可传播病毒。该病在全球分布广泛,且一旦发病,死亡率几乎为100%,因此给人类健康带来巨大的威胁。全球每年有5.9万人因狂犬病死亡,其中有绝大部分发生在亚洲和非洲的发展中国家。狂犬病毒属于狂犬病毒属弹状病毒科,病毒基因组编码五种结构蛋白,病毒在转录的过程中不仅产生这五种结构蛋白的mRNA,也会产生一段5’端没有帽子结构,3’端没有poly A尾巴的非编码RNA,名为先导RNA。有研究用末端标记的狂犬病毒基因组与被固定毒感染12小时的BHK-21细胞产物做杂交,检测到狂犬病毒感染后产生的先导RNA,长度主要是56 nt和58 nt,其中56 nt的先导RNA的量约是58 nt长度的两倍。并且检测被固定毒感染24小时的细胞时,结果相同,但先导RNA的量比感染后12小时少。该研究中同样也发现了先导RNA有其他的长度,如43 nt、60 nt。狂犬病毒和水泡性口炎病毒的核蛋白都能通过与先导RNA的互作来影响病毒转录和复制之间的转换,决定了病毒是以转录为主还是以复制为主。在狂犬病毒感染时,狂犬病毒核蛋白与先导RNA的互作比核蛋白与核蛋白mRNA的互作、核蛋白和其他非病毒RNA的互作都更强,证明与非病毒RNA和病毒的mRNA相比,核蛋白会优先结合先导RNA。核蛋白和磷蛋白同时表达时,磷蛋白会使核蛋白结合其他RNA的能力降低,但不影响核蛋白结合先导RNA。但是,先导RNA本身的作用以及先导RNA表达的调控机制并不清楚,本实验旨在研究先导RNA的产生、功能以及与宿主之间的关系。以狂犬病毒街毒株DRV-AH08作为研究对象,来研究狂犬病毒的先导RNA。DRV-AH08感染小鼠后提取总RNA建先导RNA文库,通过Sanger测序我们发现,DRV-AH08的先导RNA形式多样,但最主要的长度是64 nt。随后我们用DRV-AH08感染SK-N-SH细胞,并在感染早期提取总RNA建先导RNA文库,然后做高通量测序,高通量测序的结果显示先导RNA的主要长度仍是64 nt。虽然先导RNA长度不同,但是我们预测了56 nt、58 nt和64 nt的先导RNA的二级结构发现,它们的二级结构相似。为了进一步研究先导RNA的功能,我们利用人类腺病毒表达载体,在细胞中和活体中过表达先导RNA。首先是细胞中,用表达载体过表达不同长度的先导RNA,然后感染不同剂量的狂犬病毒(0.01MOI和0.1MOI)发现56 nt、58 nt和64 nt长度的先导RNA均能抑制狂犬病毒的感染,并且我们用体外转录产生的64nt先导RNA转染细胞验证了先导RNA对狂犬病毒感染的抑制作用。然后我们将过表达先导RNA和过表达对照RNA的人类腺病毒通过脑三维立体定位注射的方式分别注射到同一只小鼠的左右脑海马区,再感染狂犬病毒,最后发现在活体水平过表达先导RNA仍然能抑制狂犬病毒的感染。同时我们也在SK-N-SH细胞中再次验证了,过表达先导RNA时,狂犬病毒的基因组RNA显著性减少。通过RNA免疫共沉淀试验我们发现,先导RNA存在时,能抑制狂犬病毒核蛋白与基因组RNA结合。这表明,先导RNA可以通过抑制核蛋白与基因组结合来抑制狂犬病毒的复制。RNA和蛋白互作试验证实宿主中的热休克同源70 KD蛋白,Hsc70,可以与先导RNA互作,并且这种互作是直接的互作。Hsc70和先导RNA互作3D结构模拟结果显示,Hsc70的核酸结合区域可能是结合了先导RNA 51 nt-59 nt的AU富集区。抑制Hsc70的表达可以促进先导RNA的水平升高。同时Hsc70表达水平降低,会导致狂犬病毒的复制减少。而反过来,狂犬病毒感染后也会影响Hsc70的表达,狂犬病毒感染后2小时,Hsc70的水平显著下降,但是感染后36小时,Hsc70的水平又显著升高。这种不同的变化促使我们进一步研究了Hsc70、先导RNA和病毒基因组RNA之间的关系。我们发现狂犬病毒感染早期会抑制Hsc70的产生,从而导致先导RNA含量增加,进而抑制了病毒的复制,而在感染晚期,Hsc70的表达水平升高,先导RNA含量下降,病毒开始大量复制。这种病毒自我调节复制的现象在很多病毒感染时都出现过。鉴于先导RNA能抑制狂犬病毒的复制,我们又通过体外试验和体内试验证实了,感染狂犬病毒后再过表达先导RNA,仍然能够抑制病毒的复制,这提示我们先导RNA可以被开发成狂犬病毒暴露后预防的辅助药物。