论文部分内容阅读
目的:针对一种衍生于载脂蛋白E(apoE)受体结合区域的模拟肽,即新一代aopE拟肽COG1410,研究其应用于实验性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后早期脑损伤(early brain injury,EBI)期间,对大脑自噬及凋亡的影响及潜在的机制。方法:选用颈内动脉穿刺法建立小鼠SAH模型,首先利用蛋白免疫印迹方法测定伤侧大脑半球自噬标志物LC3II/LC3I、Atg-5和Beclin-1、凋亡产物Cleaved-Caspase-3(c-Caspase-3)及磷酸化的信号蛋白糖原合酶激酶3β(The phosphorylation of glycogen synthase kinase-3 beta,p-GSK-3β)等在SAH后6小时、24小时、48小时和72小时的水平变化;然后针对自噬水平最活跃的时间点进行COG1410给药试验,采取Garcia评分评价假手术组(Sham)、蛛网膜下腔出血组(SAH)、给生理盐水组(SAH+Saline)和给COG1410组(SAH+COG1410)中小鼠的神经功能变化,根据SAH分级系统评价以上四个分组中小鼠脑组织标本的蛛网膜下腔出血程度,利用蛋白免疫印迹方法测定伤侧大脑半球中LC3II/LC3I、Atg-5和Beclin-1、c-Caspase-3及p-GSK-3β等的表达量,并使用免疫荧光染色法观察伤侧大脑前额叶基底皮层区域中神经元表达c-Caspase-3的情况。最后,我们通过侧脑室穿刺给予糖原合酶激酶3β的抑制剂LY294002(LY)和激动剂Okadaic acid(OA),分别实现对p-GSK-3β水平的提升和下调,并在SAH+Saline组,SAH+COG1410组,SAH+COG1410+DMSO组,SAH+COG1410+LY组和SAH+COG1410+OA组中,利用免疫荧光染色法记录其如何影响COG1410给药后模型伤侧大脑半球及神经元的自噬,并利用蛋白免疫印迹方法测定伤侧大脑自噬标志物LC3B-II和Beclin-1表达量,以及伤侧大脑前额叶基底皮层区域LC3B-II或Beclin-1表达阳性的神经元数量。结果:(1)在SAH后EBI期间,与假手术组相比,伤侧大脑半球整体的自噬水平在SAH后6h开始增加(P<0.05),并在24h达到高峰(P<0.01),随后逐渐下降,信号分子p-GSK-3β的水平也有类似的变化趋势;通过小鼠尾静脉注射给予COG1410后,SAH后24小时的大脑自噬被进一步增强(P<0.05)。(2)在SAH后的EBI中,伤侧大脑半球整体凋亡水平变化并不完全和自噬及p-GSK-3β水平变化同步,其在EBI后期仍保持相对高值,但有减弱的趋势;给予COG1410后,伤侧大脑半球及其前额叶基底皮层神经元的凋亡水平均被下调(P<0.05)。(3)与假手术组(16.50±1.05)相比较,模型组的Garcia评分(11.17±1.83)明显降低(P<0.01),COG1410的干预能显著改善模型组的Garcia评分(15.17±0.75),且二者相比较有统计学意义(P<0.01),但COG1410的干预对于SAH的分级影响并不大。(4)此外,糖原合酶激酶3β的磷酸化进一步提升了COG1410上调的自噬;与此相反,糖原合酶激酶3β的去磷酸化则下调了该过程。结论:SAH后EBI中小鼠伤侧大脑半球的自噬和凋亡均增强,并均在伤后24h达到峰值;伤侧大脑半球的凋亡在EBI后期仍维持了较高的水平;载脂蛋白E拟肽COG1410应用SAH模型小鼠后,其神经元中GSK-3β磷酸化水平增加,自噬被增强,而凋亡被减弱;COG1410或能够通过磷酸化GSK-3β,作用于神经元的自噬和凋亡,从而改善SAH后EBI期间的神经功能缺损。COG1410上调的自噬或许可以应用于SAH后EBI的治疗研究。