南极磷虾,又称南极大磷虾,是生存在南极洲水域中的小型浮游动物,其种群数量巨大,对于维持南大洋的生态平衡意义重大。正由于其生存环境的特殊性,使得南极磷虾体内含有丰富的活性物质成分,如活性多肽。多肽是一类由氨基酸通过肽键连接起来的化合物,其分子量的大小介于蛋白质和氨基酸之间。研究表明,大部分多肽在一定程度上具有抗氧化、抗菌、降血压、降血脂等功效,因此对于多肽的研究一直是科研的热点。本课题以南极磷虾虾粉为原料,选用蛋白酶酶解获得多肽组分,采用超滤技术获得分子量范围不同的多肽。通过比较四个抗氧化指标综合评定分子量范围对多肽抗氧化活性的影响,通过牛津杯法评价分子量范围对多肽抗菌活性的影响,并采用高速逆流色谱技术对活性较好的多肽组分进行分离纯化,最终通过氨基酸分析探究抗氧化活性和抗菌活性与组成之间的关系。本研究以获得抗氧化活性最优和抗菌活性最优的多肽为实验目标,首先以蛋白质的水解程度为评价依据,通过对比中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合酶对南极磷虾虾粉的水解效果,最终选用复合酶作为酶解南极磷虾虾粉的蛋白酶。其酶解工艺为:加酶量2000U/g,料液比1:10,酶解温度50℃,pH 7.5,酶解时间4h。将灭酶后的酶解液进行超滤分离截留出5个肽段,并对这些多肽进行抗氧化指标的测定,结果表明,分离得到的多肽具有较好的清除超氧阴离子、DPPH自由基、羟基自由基以及螯合Fe²⁺的能力,其中以分子量范围在5¹0KDa的多肽抗氧化活性最好。当多肽浓度为10mg/mL时,其超氧阴离子自由基清除率达到21.28%,DPPH自由基清除率为86.52%,对羟基自由基清除率达到53.49%,Fe²⁺螯合率为85.35%。而对超滤分离后的南极磷虾多肽经抗菌研究表明,分子量范围在1³KDa的多肽具有一定的抗菌效果,当多肽浓度为50mg/mL时,对金黄色葡萄球菌的生长有明显的抑制作用,其抑菌圈大小为30.18mm,对副溶血性弧菌的生长有微弱的抑制作用,其抑菌圈大小为8.41mm,而对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌无明显抑制作用。将分子量范围在5¹0KDa的多肽命名为E-OP,对其进行高速逆流色谱分离纯化,其分离条件为:氯仿-丁醇-甲醇-水=4:0.75:3:2作为两相溶剂体系,下相作固定相,上相作流动相;反转,转速900r/min;恒温水浴温度为25℃;流动相的流速1.5mL/min,进样浓度20mg/mL。在此体系下分离得到P1-P5五个组分,其中P2组分的DPPH自由基清除率最高,为90.33%;P3组分的Fe²⁺螯合率和超氧阴离子自由基清除率最高,分别为92.33%和37.18%;P5组分的羟基自由基清除率最高,为70.11%。对P2、P3、P5进行氨基酸分析,通过对比含量较高的氨基酸种类与清除率之间的关系,从而推断出疏水性氨基酸在清除DPPH自由基和羟基自由基中占主要作用;而碱性氨基酸在清除超氧阴离子自由基和Fe²⁺螯合能力中起主导作用。通过色谱技术进行纯度鉴定,得到P2、P3、P5均为单一峰,纯化效果良好。将分子量范围在1³KDa的多肽命名为E-BP,并对其进行高速逆流色谱分离纯化。最终分离E-BP的条件为:甲基叔丁基醚:乙腈:水=2:3:3作为两相溶剂体系,下相作固定相,上相作流动相;反转,转速900r/min;恒温水浴温度为25℃;流动相的流速1.0mL/min,进样浓度15mg/mL。在此条件下得到P1和P2两个组分,其中P1组分的抗菌活性最好,当多肽浓度为50mg/mL时,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为32.16mm,对副溶血性弧菌的抑菌圈大小为10.34mm。对P1组分进行氨基酸分析,推断出脯氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸与其抗菌活性有关。并对P1组分进行纯度鉴定,得出P1为单一峰,纯化效果良好。