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CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术之后的一种新的高效靶向基因组定点编辑技术。由于其设计简单、耗时短、效率高,被广泛应用于基因功能的研究。CRISPR/Cas9在sgRNA的引导下对靶基因进行编辑,编辑的主要结果是导致靶基因功能的丧失。在此基础上,人们通过点突变使核酸酶Cas9蛋白的H840A和D10A位点失活,获得无切割活性而只有结合DNA能力的dCas9,其在sgRNA(single guide RNA)的引导下通过空间位阻效应抑制靶基因的转录,并将该系统命名为CRISPRi(CRISPR interference,CRISPR干扰)。随后,人们进一步将dCas9与Kruppel associated box(KRAB)结构域融合,实施对靶基因的转录抑制,其抑制效率得到了极大的提高(可达到90%～95%),且具有极低的脱靶效应。因此,CRISPR/dCas9在基因表达调控研究方面具有重要的应用价值。然而对于一些具有非常重要生理功能的基因来说,持续抑制其表达可能会导致细胞功能的异常。为了更有效、精确地调控目的基因在细胞中的表达,本课题将Tet-on调控系统与CRISPRi系统联合应用,实现对靶基因的诱导调控表达。该系统不仅可以准确、高效地沉默目的基因,且可以灵活地对靶基因表达抑制的程度进行调控,因此在基因的功能研究方面具有重要的意义。颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)作为功能多样的生长因子蛋白,具有促进细胞增殖、伤口修复、抗炎等生理功能。且PGRN在许多肿瘤细胞系中表达量升高,如乳腺癌细胞系MDA-MB-231、恶性脑胶质瘤细胞系U87及神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y等。PGRN的过量表达能够促进肿瘤的发生和发展,如果降低PGRN的表达水平可显著降低肿瘤的形成,说明PGRN是肿瘤发生发展中的重要分子之一,可以作为肿瘤诊断和治疗的良好靶标分子。但目前对其在肿瘤细胞中所发挥生物学功能的分子机制尚不清楚,对其进行转录调控的研究将为阐明该分子在肿瘤细胞中发挥生物学功能的分子机制奠定基础。本课题旨在建立一种高效的可诱导的转录调控系统,并在此基础上建立PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的SH-SY5Y细胞系,从而为探索PGRN在神经母细胞瘤中作用的分子机制研究提供一种新思路。本课题从3个方面进行了研究,并取得了以下结果:1.Tet-on诱导的靶向PGRN的转录抑制系统的构建及体外实验研究:首先,构建了携带Tet-on系统的慢病毒表达载体,利用Luciferase报告基因对Tet-on系统进行检测,结果显示其诱导倍数可达到180倍;其次,设计和筛选了靶向人源PGRN启动子区的sgRNAs(1-4),将其分别克隆至Tet-on诱导表达dCas9-KRAB融合基因的慢病毒载体中,由此获得了 Tet-on诱导的靶向PGRN的转录抑制系统;最后,为了检测该系统对外源性PGRN启动子的转录抑制效率,构建了pGL3 basic-PGRN promoter-Luciferase质粒,将其与表达靶向 PGRN 的 Tet-on诱导的转录抑制系统的慢病毒载体共同转染HEK293细胞,检测Luciferase活性,结果显示,在Dox存在下,sgRNA3引导的靶向PGRN的Tet-on诱导的转录抑制系统对外源性PGRN启动子的抑制效果最好,抑制效率达到10倍。上述结果表明,所建立的基于慢病毒载体的靶向PGRN的Tet-on诱导的转录抑制系统能够有效抑制外源性PGRN启动子的活性。2.PGRN-T2A-Luciferase Knock-in HEK293 细胞系和 HepG2 细胞系的建立和体外实验研究:为了测试所构建的Tet-on诱导的转录抑制系统对内源性PGRN启动子的抑制效率,首先设计了靶向人源PGRN启动子下游的sgRNAs(1-4),并构建了相应的sgRNAs(1-4)的表达载体,将其分别与Cas9表达载体共同转染HEK293细胞,检测sgRNA的打靶效率,结果显示sgRNA2的打靶效率最好;其次,构建用于同源重组的含有打靶区域上下游同源序列和T2A-Luciferase外源基因的供体载体,并将其与表达Cas9和sgRNA2的打靶载体共同转染HEK293细胞或HepG2细胞系,经过筛选及克隆化后,采用PCR和测序方法进行鉴定,最终获得单等位基因敲入的PGRN-T2A-Luciferase knock-in HEK293细胞系和HepG2细胞系。在此基础上,将携带靶向PGRN的Tet-on诱导的转录抑制系统的慢病毒载体分别转染已建立的PGRN-T2A-Luciferase knock-in HEK293细胞系和HepG2细胞系。结果表明,sgRNA引导的转录抑制系统对PGRN-T2A-Luciferase knock-in HEK293细胞系中PGRN启动子的活性无显著性抑制作用,而对PGRN-T2A-Luciferase knock-in HepG2细胞系中PGRN启动子的活性具有抑制作用,其中sgRNA3引导的转录抑制系统对PGRN-T2A-Luciferase knock-in HepG2细胞系中内源性PGRN启动子的转录抑制效果相对较好。3.PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的SH-SY5Y细胞系的建立及体外实验研究:将携带测试活性较好的受Tet-on诱导的转录抑制系统的慢病毒载体进行包装、纯化,然后将之感染人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y,建立PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的SH-SY5Y细胞系;通过Real-time PCR和Western Blot检测所建立的细胞系中PGRN mRNA和蛋白的表达水平。结果显示,在Dox存在下,SH-SY5Y细胞系中PGRN的mRNA和蛋白的表达量显著性降低,表明该系统能有效抑制SH-SY5Y细胞系中的PGRN启动子的转录活性。该系统的建立为研究PGRN的功能奠定了基础。