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鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳属(Eimeria)的单细胞寄生原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一,遍及世界各地。多年来众多科学家对本病进行了大量的研究工作。先后研制出了大量抗球虫药物,并应用于临床实践。但由于耐药虫株的出现及残留药物对人体的危害,使药物防治受到限制。免疫预防已成为当前研究的热点。目前应用的一些球虫疫苗都是活疫苗,对鸡具有一定的潜在致病力,活疫苗的使用因此受到一定的限制。采用基因工程技术获得的重组疫苗,特别是以病毒和细菌为活载体的疫苗逐渐受到青睐。鸡痘病毒(Fowlpox Virus,FPV)是继痘苗病毒之后又一种重要的动物病毒表达载体,它具有严格的宿主特异性和生物安全性,从而使它成为禽类病原基因工程活载体疫苗研制过程中的一种应用极为广泛的工具。但目前国内还没有人在构建球虫保护性基因鸡痘重组病毒方面开展工作。本研究把E.tenella S07基因和本实验室发现的Rhomboid蛋白家族相关基因为重组疫苗的侯选基因,将此二基因插入到鸡痘病毒载体复合启动子下游,成功构建了鸡痘重组病毒载体,在鸡胚成纤维细胞上进行鸡痘重组病毒载体质粒和鸡痘病毒的共转染、BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR,蛋白印迹检测,确定三株球虫鸡痘重组病毒。经CEF扩毒后,免疫七日龄鸡雏,结果表明所筛选的三株目的基因鸡痘重组病毒有很好的免疫原性,可诱导免疫动物产生强烈的免疫应答,具有一定的免疫保护力。具体研究内容如下: 目的基因的扩增、克隆和测序:将卵囊用蔗糖法进行纯化,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,成功扩增出S07基因ORF,包括651bp,将该基因片段与GenBank上登陆的S07基因进行基因序列比较,结果表明:本实验扩增的S07基因与上述基因序列的同源性为97.7%;同时,成功扩增Rhomboid蛋白家族相关基因(以下以Rhomboid代替)ORF包括774bp。 鸡痘重组病毒的构建、转染和鉴定:将S07基因和Rhomboid基因分别单独或同时插入鸡痘病毒表达载体PUTA2的复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建携带球虫保护性抗原基因的重组病毒转移载体PUTA-S07,PUTA-Rhomboid,PUTA-S07-Rhomboid,应用质脂体转染法将三个重组病毒转移载体与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR,SDS-PAGE、蛋白印迹检测,筛选获得三株能正确表达球虫抗原基因的重组鸡痘病毒rUTh-S07、vUTA-Rhomboid、vUTA-S07-Rhomboid。