理想的基因治疗应该具备以下三方面的要求:基因治疗的有效性、基因治疗的靶向性和基因治疗的安全性.近年来出现的寡核苷酸介导的基因定点修复策略,可针对基因位点的缺陷进行原位矫正,使修复的基因能够在其本身的染色质环境和调控序列调节下进行适宜水平的表达,是基因治疗的理想模式,具有比传统策略更明显的优越性.从寡核苷酸修复术的发展过程考虑,本文建立一种灵敏、方便、稳定、可靠的报告系统.实验证明,本系统直接、快速、准确地测定了定点修复事件的发生,结果稳定,为机制研究建立了良好的实验平台.在本系统研究中,发现寡核苷酸的作用表现出明显的链偏向性,即针对正义链的打靶分子起效,而与之互补的另一条打靶分子几乎没有修复作用,支持了Kmiec和Yoon等人提出的SSO作用的转录相关因素.结合本实验室前期研究所发现的提高效率的复制相关因素,我们认为寡核苷酸的定点修复作用是包括转录、复制、错配修复等与细胞功能密切相关的多因素、多环节共同参与、作用的结果,不能简单用一种机制解释.本实验室曾发现经硫代修饰的SSO修复后发光细胞丧失了正常的分裂能力而无法获得纠正后的细胞克隆,因此我们利用新获得的细胞系继续对这一现象进行了观察,初步判断了SSO的修复对细胞分裂能力的影响.在有效提高寡核苷酸介导的基因定点修复效率的基础上,下一步的工作中,我们将利用AS-PCR、PCR-RFLP、DNA测序、Southern blot、Westernblot等多种检测方法,从多水平验证靶位点的特异性改变,在该实验平台基础上,结合本实验室前期工作,进行更加完整而系统的寡核苷酸作用机制的研究.