梅花花器官cDNA文库的构建及其PmAP<,3>、PmPI、PmAG基因的克隆

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梅花(Prunus mume Sieb.et.Zucc.)是我国传统名花,品种繁多,蕴含丰富的遗传信息。梅幼年期较长,杂交育种进展缓慢,致使梅花重要的观赏性状和农艺性状研究严重滞后。通过梅花花器官cDNA文库的构建以及花发育相关基因的克隆,研究梅花花发育相关理论,为加速梅花育种及性状改良提供理论依据。主要结果如下:   1.用Biozol法、SDS法和CTAB法三种方法提取梅花组织总RNA。Biozol法操作简单,实验过程短,但总RNA完整性被破坏。SDS法提取的总RNA有降解,并且还有少量DNA污染。CTAB法能够提取高质量总RNA,总RNA完整性较好,没有降解,28s RNA和18s RNA的比例接近2:1。   2.构建梅花花器官cDNA文库,随机挑选克隆测序获得了239条高质量EST序列。构建的原始文库滴度为5.41×106 pfu/ml,重组率为97.29%,所得原始文库滴度及重组率符合建库要求;原始文库经扩增后共得到约200ml库液,扩增文库的滴度1.31×1010 pfu/ml,扩增文库滴度符合预期数量级;文库插入片段在500bp-1200bp之间,平均为800bp左右,插入片段大小基本符合要求,文库质量比较高。利用MIPS数据库对239条EST序列比对。结果175条序列和拟南芥已知基因相似性很高,占73.22%;35条序列与拟南芥基因功能尚未确定的假定蛋白或未知蛋白同源性很高,占14.64%;29条序列和拟南芥已知基因没有同源性,占12.13%。   3.通过同源序列法,利用RACE和TAIL-PCR从梅花花器官中成功克隆到PmAP3、PmPI、PmAG三个全长基因。PmAP3的全长为975bp,包含一个完整的读码框,编码202个氨基酸。将PmAP3基因推测的氨基酸序列在NCBI上进行Blastp搜索发现,PmAP3蛋白是AP3-like蛋白。PmPI的全长为888bp,包含一个完整的读码框,编码210个氨基酸。将PmPI基因推测的氨基酸序列在NCBI上进行Blastp搜索发现,PmPI推测蛋白是PI-like蛋白。PmAG的全长为1171bp,包含一个完整的读码框,编码243个氨基酸。将PmAG基因推测的氨基酸序列在NCBI上进行Blastp搜索发现,PmAG推测蛋白是AG-like蛋白。   4.成功构建PmAP3、PmPI基因超量表达载体,为进一步研究B类基因的功能打下基础。
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