三甲基氯化锡(trimethyltin chloride,TMT)作为一种有机锡稳定剂,主要用于塑料生产过程中,因其环保效果好,用量少,透明度高而被广泛使用,并逐渐替代含铅稳定剂。对TMT的毒性机制研究不仅有理论意义,可以更好地解释描述性毒性资料和评估其引起的有害效应,而且对制定TMT卫生标准和防治中毒有实际意义。　　本文拟分三部分研究TMT的毒性机制,第一部分建立整体动物实验TMT中毒模型,在本实验室复制TMT中毒,寻找TMT神经毒性表现的特异性指标,并观察NF-κB,泛素在该模型中的变化;第二部分建立体外TMT中毒实验模型,寻找TMT作用的最佳浓度和时间,并在此浓度和时间下检测对NF-κB,泛素表达的影响,为毒性途径研究建立合适的模型;第三部分利用蛋白酶体抑制剂,探讨泛素蛋白酶体途径是否介导了NF-κB的激活在TMT神经毒性中的作用,以进一步阐明TMT中毒机制,为TMT毒性研究以及国家标准制定提供依据。　　第一部分:TMT中毒整体动物模型的建立及其对NF-κB、泛素表达的影响　　目的:建立TMT的整体动物大鼠神经毒性模型。检测NF-κB、IκBα、泛素的表达。　　方法:健康成年雄性SD大鼠按体重随机分为4组,每组10只,分别为对照组(双蒸水)、TMT染毒组(mg/kg):0.75、1.5及3。经口灌胃染毒共6天,每天一次。实验期间实施水迷宫实验,末次染毒24h后称量体重,断头处死大鼠,测血清K+浓度;分离大脑,脑组织石蜡切片尼氏染色,免疫组织化学法检测NF-κB、Ub在海马中的表达,Western-blot法检测IκBα表达。　　结果:(1)体重:与对照组相比,TMT低中剂量组体重无明显变化,高剂量组第6天开始体重有明显降低(P<0.05)。(2)血清K+浓度:与对照组相比,TMT低、中剂量组血清K+浓度无明显变化,高剂量组血清K+浓度明显下降(P<0.05)。(3)定位航行实验:各组大鼠随时间的增加,逃避潜伏期显著缩短(P<0.05),而TMT高剂量组从第5天开始,时间反而明显延长,与第4天相比差异均有统计学意义(P<0.05);TMT中剂量组第6天时间延长,与第5天相比,差异有统计学意义(P<0.05);空间探索实验:各组大鼠在目标象限停留的时间都超过了20％,中、高剂量组大鼠跨越原平台次数、在目标象限停留的时间和对照组相比都明显减少(P<0.05);(4)尼氏染色:对照组CA3区,椎体细胞较多,胶质细胞较少,DG区细胞排列致密,染色均匀;高剂量组CA3区椎体细胞明显减少,胶质细胞增多,DG区细胞排列散乱,不致密;(5)NF-κB:正常对照组胞浆中有少量棕黄色颗粒,核蓝紫色,而3mg/kg组,核棕黄色明显加深;(6)TMT染毒组IκBα表达水平随剂量增加而增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);(7)对照组中可见Ub少量阳性表达,高剂量组胞浆棕黄色明显加深,中剂量组和低剂量组弱阳性表达。　　结论:(1)在本实验室条件下,观察到3mg/kg剂量组中毒情况:体重下降,学习记忆能力减退明显,血清K+浓度明显降低,海马尼氏小体染色变浅或消失,海马神经元损伤成为TMT神经毒作用的特异性指标,说明TMT神经毒性整体实验模型在本实验室建立成功;(2)本实验模型中存在NF-κB转核,IκBα表达水平随TMT剂量增加而增加,提示NF-κB信号通路可能在TMT神经毒性中发挥一定作用;(3)本实验模型中存在泛素蛋白酶体途径的活化,且和NF-κB表达水平变化一致,提示泛素蛋白酶体途径可能介导了TMT神经毒性中NF-κB的激活。　　第二部分:TMT中毒体外模型的建立及对NF-KB、泛素表达的影响　　目的:以SH-SY5Y为研究对象,建立TMT体外中毒模型;探讨TMT对SH-SY5Y细胞NF-κB、IκBα、Ub表达水平的影响。　　方法:MTT法测TMT对SH-SY5Y细胞存活率的影响;Western-blot法检测NF-κB、IκBα;免疫细胞化学法检测Ub表达变化。　　结果:(1)12h细胞存活率(%)范围:100～82;24h存活率(%)范围:98～54。(2)随着TMT剂量的增加,胞核NB-κB表达水平逐渐增加(P<0.05);IκBα表达水平逐渐下降,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);(3)Ub:TMT染毒组细胞核为蓝色,棕黄色颗粒位于胞浆中,且随剂量增加,棕黄色加深;而正常对照组只见蓝色胞核,胞浆中见少量棕黄色颗粒。　　结论:确定了TMT对SH-SY5Y细胞的作用剂量(μmol/L)为1.25、2.5、5、10,染毒时间为12h,后续实验中TMT均采用该剂量梯度和时间;(2)1.25μmol/LTMT即可引起NF-κB胞核蛋白中表达增加,说明NF-κB在TMT对SH-SY5Y细胞中可以被激活,且与TMT存在剂量关系;而IκBα表达水平也随着TMT剂量增加而降低,亦证实NF-κB激活;(3)与对照组相比,TMT染毒组泛素阳性表达增加,且存在一定的剂量反应关系,提示泛素蛋白酶体途径可能参与TMT神经毒作用过程。　　第三部分:利用蛋白酶体抑制剂MG-132研究TMT诱导NF-κB信号通路激活的可能机制　　目的:确定蛋白酶体抑制剂MG-132的作用剂量和作用时间,探讨MG-132与TMT共同作用对SH-SY5Y细胞NF-κB,IκBα,泛素化蛋白表达水平的影响及IκBα与泛素的相互作用;观察MG-132与TMT共同作用对细胞存活率和形态的影响。　　方法:MTT法测定不同剂量MG-132作用12h细胞存活率;Western-blot法检测正常组、MG-132(1.25μmol/L)、TMT(5μmol/L)、MG-132(1.25μmol/L)+TMT(5μmol/L)组NF-κB,IκBα、泛素化蛋白的表达,免疫共沉淀法检测IκBα泛素化水平;MTT法检测MG-132与TMT共同作用12h细胞存活率。　　结果:(1)MG-132作用12h,细胞存活率显著下降,1.25μmol/L时细胞形态较好;(2)MG-132+TMT组NF-κB、IκBα表达无明显改变(P>0.05);与其他组相比,MG-132组和MG-132+TMT组泛素化蛋白明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与其他组相比,MG-132+TMT组IκBα的泛素化水平没有明显增加(P>0.05);(3)MG-132和TMT共同作用后可使细胞存活率显著下降(P<0.05),但可以明显改善细胞形态。　　结论:(1)确定了MG-132的作用剂量为1.25μmol/L,时间为12h。(2)MG-132与TMT共同作用后并未明显的抑制TMT引起的NF-κB的核转录;也不能明显的抑制IκBα的泛素化,而泛素化蛋白表达水平明显增加,提示TMT诱导SH-SY5Y细胞NF-κB信号通路的激活与IκBα泛素化降解无关,可能存在其他激活机制;(3)MG-132可能对TMT毒性作用仍有拮抗作用,比如突触可塑性,本研究中选择细胞存活率作为毒性指标,有一定局限性,值得进一步深入研究。