论文部分内容阅读
弓形虫(Toxoplasma gondii)是严重危害人类健康的机会致病性寄生虫。目前，弓形虫病研究的两大热点仍然是寻找敏感性高、特异性强的诊断抗原和有效的候选疫苗分子，基因重组技术为该研究提供了可行之路。已知生物体进化过程中，14-3-3家族是一组真核细胞表达的保守蛋白，细胞内五十多种信号蛋白是其配体，通过结合激酶、磷酸酶、跨膜受体等多种配体成为信号转导和细胞周期调控介质。本课题从弓形虫分裂增殖生命活动重要环节——细胞信号转导途径寻找重组诊断和候选疫苗分子。根据GenBank收录的弓形虫Beverley株猫肠上皮细胞期信号蛋白14-3-3 mRNA序列，设计并合成引物，RT-PCR，扩增出RH株速殖子14-3-3(Toxo14-3-3)基因，克隆入pGEM-T载体，经酶切和PCR法鉴定及DNA测序证实；Toxo14-3-3具有一个长度为798bp的完整开放阅读框(ORF)，编码265个氨基酸，理论分子量31KDa，与GenBank收录(编号为ABO12775)的弓形虫14-3-3基因完全一致；将目的基因亚克隆入双表达质粒pBK-CMV、转化宿主菌E.coliXL-1 blue，获得pBK-CMV/Toxo14-3-3阳性重组子，IPTG诱导目的蛋白表达，表达产物经SDS-PAGE显示在31Kda—43KDa之间有一条明显的蛋白表达条带，理论推测为Toxo 14-3-3蛋白(31 KDa)和β-半乳糖苷酶(3 KDa)融合蛋白，但在凝胶中的实际迁移率慢于理论预期值(34 KDa)，分子量超出约5KDa，Western-blot法鉴定该蛋白表达条带能被兔抗鼠14-3-3ε多克隆抗体识别，证实为Toxo14-3-3融合蛋白。