【摘 要】
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目的:利用RNA干扰技术抑制XIAP在人白血病细胞HL-60中的表达,观察siRNA干扰后HL-60细胞对化疗药物阿霉素处理的敏感性。 方法: 1.根据siRNA靶序列设计原则, 运用生物信息
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目的:利用RNA干扰技术抑制XIAP在人白血病细胞HL-60中的表达,观察siRNA干扰后HL-60细胞对化疗药物阿霉素处理的敏感性。
方法:
1.根据siRNA靶序列设计原则, 运用生物信息学设计出XIAP 4个位点的干扰序列,运用PCR产生siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs),然后分别转染指数生长期的HL-60细胞, 用实时定量荧光PCR检测XIAP mRNA,筛选出抑制效率较高的siRNA序列。将筛选出的siRNA序列插入siRNA真核表达质粒psilencircle中,构建psilecircle-XIAPsi,并构建相应的siRNA乱序对照表达质粒psilecircle-XIAPsc。
2. Psilecircle-XIAPsi,psilecircle-XIAPsc分别转染HL-60细胞,挑选稳定表达psilecircle-XIAPsi的细胞克隆,实时定量荧光PCR检测XIAP的mRNA水平的变化,Western blot检测XIAP蛋白水平的变化。用MTT法检测稳定表达此载体的肿瘤细胞对阿霉素敏感性的变化, Annexin-Ⅴ-FITC/PI双色荧光标记,流式细胞术检测细胞凋亡率。
结果:在待选的四个siRNA干扰位点中,位点(94-112)抑制效率最高,可达到83.1%。构建psilecircle-XIAPsi,psilecircle-XIAPsc,StuⅠ酶切电泳,可见4800bp左右的条带,DAN测序结果与设计序列一致,表明psilecircle-XIAPsi,psilecircle-XIAPsc真核表达载体构建成功。Psilecircle-XIAPsi转染HL-60细胞表达后,实时定量荧光PCR检测XIAP mRNA、Western blot检测XIAP蛋白,与未转染组相比明显抑制了XIAP蛋白的表达;MTT检测细胞对阿霉素的敏感性,与未转染组相比敏感性增加了4倍;用阿霉素作用48h后,Annexin-Ⅴ-FITC/PI双色荧光标记,流式细胞术检测凋亡率,转染组HL-60细胞与未转染组相比,凋亡率明显增加。
结论:针对XIAP的siRNA抑制了XIAP的表达,能够增加HL-60细胞对阿霉素处理的敏感性。
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