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目的 构建SARS病毒E、M、N基因真核及原核表达重组质粒,评价这3种基因在SARS病毒感染快速诊断以及疫苗研制中的价值。 方法 通过PCR扩增获得SARS-CoV E、M、N基因片断,将其分别克隆入真核表达载体pVAX1,将所得真核表达重组质粒pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N分别肌肉注射小鼠和兔子,检测动物体内抗SARS-CoV抗体,观察实验期间动物的体重变化,处死后对重要脏器进行病理检查。将SARS-CoV E、M、N基因片断克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,优化表达条件、纯化重组蛋白。以重组蛋白pGEX-4T-1╱N为抗原,检测真核表达重组质粒注射动物血清中抗体。 结果 真核表达重组质粒pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N以及原核表达重组质粒pGEX-4T-1/E、pGEX-4T-1/M和pGEX-4T-1/N基因测序结果与Gene bank公布的一致。真核表达重组质粒经肌肉注射免疫小鼠和兔子后,在动物体内能够诱导产生特异性抗SARS-CoV抗体。通过观察动物一般状态和对重要脏器的病理研究显示,重组质粒安全无害。经过IPTG诱导,SDS-PAGE电泳可见pGEX-4T-1/N BL21(DE3)有特异蛋白表达带。诱导后的pGEX-4T-1/EBL21(DE3)和pGEX-4T-1/M BL21(DE3)菌体沉淀以鼠抗GST. tag为一抗,进行Western blot,可发生免疫印剂反应。通过western blot分析显示重组蛋白pGEX-4T-1/N可与小鼠重组质粒pVAX1-N免疫血清发生免疫印迹反应。 结论 真核表达重组质粒pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N具有较好的免疫原性和安全性,有可能成为具有预防作用的基因疫苗。pGEX-4T-1/N BL21(DE3)可高效表达重组N蛋白,该蛋白有可能成为SARS-CoV感染血清学诊断的候选抗原之一。