目的:在法医实际检案中,经常遇到当事人在遭受持续捆绑或限制体位等束缚情形下出现意识障碍、精神异常、重要生命器官损伤甚至死亡。由于此类案件中损伤本身不足以导致上述严重后果,甚至没有明显的肉眼可见的外伤,因此,常常由于死亡原因不确定或有争议,致使案件久拖不决,造成不良社会影响。分析此类案件的特点,当事人均存在不同程度的心理应激过程。研究证实,过度而持久的心理应激可以引起精神异常,但具体机制尚不清楚,其已成为法医学领域亟待解决的科学问题。应激是指机体在受到一定强度的应激原(躯体或心理应激)作用时所出现的全身性的非特异性神经内分泌反应。在正常情况下,适度应激是一种机体自身的防御性反应,但过强或持续时间过长的应激可导致受害人多种器官功能障碍和代谢紊乱,其能力储备及防御机能被逐渐消耗,内环境严重失调、紊乱,直至出现一个或多个器官衰竭乃至死亡。HPA轴(下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴,hypothalamus-hypophysis-adrenal cortex axis)兴奋,糖皮质激素(glucocorticoid,GC)分泌增多是应激最主要的神经内分泌反应之一。正常浓度的GC对于维持机体内环境的稳态和机体的生长发育有重要意义。当应激原持续存在,或应激强度持续增强时,GC则会对中枢神经系统造成严重的损害。研究发现,过度应激时,HPA轴过度激活,高浓度GC可以引起海马神经元变性和损伤,提示GC对中枢神经系统的此类损伤很可能是心理应激导致精神损伤的机制之一。杏仁核(Amygdala)是边缘系统中最重要的核团之一,它的纤维联系和功能极其广泛,是产生、识别、调节情绪,控制恐惧学习和记忆的神经中枢,在情感记忆的形成和贮存方面起着至关重要的作用,对应激反应十分敏感。文献报道杏仁核损伤在PTSD发病中发挥重要作用。因此研究GC对杏仁核的损伤作用对于揭示心理应激引起精神损伤的机制具有重要科学意义。本研究旨在细胞水平来探讨GC对原代培养大鼠杏仁核神经元凋亡的影响,为揭示应激对杏仁核的损伤机制提供科学依据,为应激参与的、涉及精神损伤的案件的鉴定提供理论依据。方法:1本实验采用新生24h内的Sprague Dawley(SD)乳鼠,75%乙醇全身消毒后,断头取脑,解剖显微镜下于冰上快速取出双侧杏仁核,制备成单细胞悬液,接种于多聚赖氨酸(PLL)包被的细胞培养板中进行培养。2待杏仁核原代神经元发育成熟后,用免疫荧光标记技术对神经元进行MAP2神经标记物鉴定,并用免疫荧光标记技术对原代培养杏仁核神经元是否存在糖皮质激素受体(GR)进行检测。3为了明确GC能否导致原代培养杏仁核神经元的凋亡,待神经元发育成熟后,给予不同浓度的地塞米松(Dexamethasone)(10-9M-10-6M)作用48h,实验分为5组:Control、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M,药物作用后,采用流式细胞术Annexin-FITC/PI双标法检测各组的凋亡率。4为了进一步证实GC是否通过受体诱导杏仁核神经元的凋亡,本实验采用GC受体拮抗剂米非司酮(Mifepristone原代号RU486)与DEX(10-6M)共同孵育神经元,实验分为四组:Control、DEX、DEX+MIF、MIF,作用48h后,采用TUNEL技术原位检测各组细胞凋亡的情况,用Real-time PCR技术检测各组促凋亡基因BAX m RNA的表达情况。5数据以“均数±标准差(Mean±SD)”表示,用SPSS21.0软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(least significant difference,LSD)作两两比较,P<0.05为有统计学差异;结果:1杏仁核神经元原代培养结果:原代培养至8-10天时,神经元胞体饱满,呈圆形或椭圆形,立体感强,周围有光晕,神经元突起丰富,并相互交织形成网络样结构,此时神经元已经发育成熟,可用于后续实验研究。本实验原代培养技术在传统的神经元原代培养方法上进行了改进。包括全程低温操作,多次离心去除杂质,和实验器材方面的更新,使原代培养神经元有更高的存活率,质量更佳,而且神经元培养环境得到了最大优化,神经元生长较传统方法快,神经元突起的延展性表现更突出,更加便于镜下观察和后期处理。2经神经元特异性标记物MAP2对原代培养的杏仁核神经元进行鉴定,结果显示神经元细胞纯度大于90%,可以用于本实验研究。通过免疫荧光技术检测杏仁核神经元GC受体(GR),证实了原代培养杏仁核神经元细胞膜上广泛存在丰富的GR。3流式细胞术Annexin-FITC/PI双标法检测各组细胞凋亡:与Control组相比,10-8M-10-6M的DEX作用于神经元48h后,神经元凋亡率明显升高(P<0.05),且呈浓度依赖性,而10-9M组的凋亡率与Control组相比无显著性差异(P>0.05),提示一定浓度的GC能够导致杏仁核神经元凋亡。后续实验选取10-6M DEX。4 TUNEL原位检测凋亡:与对照组相比,DEX组阳性细胞表达显著升高;而与DEX组相比,DEX+MIF组阳性细胞表达明显降低(P<0.05),MIF组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。证实GC通过受体发挥诱导杏仁核神经元凋亡的作用。5 Real-time PCR技术检测促凋亡基因BAX m RNA的表达:与对照组相比,DEX组BAX m RNA的表达量明显升高(P<0.05);而与DEX组相比,DEX+MIF组的BAX m RNA的表达量明显降低(P<0.05),而MIF组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。进一步证实了GC通过受体机制诱导杏仁核神经元凋亡。结论:本研究成功进行了大鼠杏仁核神经元的原代培养,在细胞水平观察了不同浓度的GC对杏仁核神经元凋亡的影响,并通过观察神经元病理学形态变化和BAX m RNA的表达水平的改变,得出以下结论:GC通过GC受体可以独立诱导原代培养杏仁核神经元的凋亡。