井冈霉素是一种C7N氨基环醇类抗生素,主要用来防治水稻纹枯病,在亚洲有非常广泛的应用。另外,井冈霉素及其衍生物可以作为生产治疗II型糖尿病药物的前体。基于井冈霉素在农业生产中巨大的经济价值以及其潜在的药用附加值,本实验室在2005年克隆了井冈霉素生物合成基因簇,随后详细阐明了井冈霉素生物合成的机制,并于2012年测定了井冈霉素野生型产生菌5008以及工业菌株TL01全基因组。但是到目前为止有关井冈霉素生物合成调控机制的研究比较少。本论文通过对比野生型菌株5008和工业菌株TL01全基因组序列,发现井冈霉素生物合成基因的序列完全一致,但是TL01相比5008在valK-val A-int启动子区域出现了连续的137 bp缺失。我们首先在野生型菌株5008中敲除了该137bp片段,发现井冈霉素的产量增加了2倍,从原来的3.1 g/L增加到10.5 g/L。同时转录分析结果显示该缺失使得井冈霉素生物合成基因的转录量提高了2倍。在TL01的val K-valA-int启动子区域原位插入此137 bp片段,井冈霉素的产量有显著的下降,由原来的19.1 g/L减少到3.7 g/L,井冈霉素生物合成基因转录量也降低了80%左右。以上结果表明,此137 bp片段作为一个负调控顺式作用元件,通过抑制井冈霉素结构基因的转录来影响井冈霉素的合成。随后,我们利用DNA亲和层析的方法寻找可以与5008中val K-valA-int启动子区域结合的蛋白,其中有一个参与氮代谢调控的全局性调控因子GlnR。凝胶迁移实验(EMSA)和DNase I footprinting实验进一步证实,GlnR可以与5008的valK-val A-int启动子区域的两个位点结合。与此同时,在5008中敲除了基因glnR之后,井冈霉素的产量减少了80%,但是井冈霉素生物合成基因簇的转录水平却有显著的提高。另外,glnR缺失突变株相比野生型菌株5008有明显的产孢缺陷。为了进一步阐明GlnR对井冈霉素生物合成的调控机制,在5008中分别对valk-vala-int启动子区域的两个glnr结合位点进行了定点突变。glnr结合位点i突变后,井冈霉素的产量相比5008有1.5倍的提高,井冈霉素结构基因valk和vala的转录量也有了不同程度的增加;但是,glnr结合位点ii突变却使井冈霉素的产量减少了50%,valk和vala的转录水平也下降了80%。而且,在glnr结合位点ii突变株中进一步突变结合位点i,井冈霉素的产量提高了66%。上述结果表明glnr通过与valk-vala-int启动子区域两个不同位点结合,对井冈霉素的生物合成同时进行正调控和负调控。基于glnr对井冈霉素生物合成的调控机制,我们在负调控位点glnr结合位点i突变的菌株jg45中高表达基因glnr,48小时井冈霉素的发酵产量相比对照菌株提高了41%。并且在工业菌株tl01中高表达基因glnr,48小时井冈霉素的产量也增加了40%左右。前期研究发现井冈霉素生物合成受到温度的调控,但其具体的调控机制还有待进一步阐明。我们通过转录组表达谱芯片分析了5008在30℃和37℃培养条件下的转录谱变化,发现了一个sarp家族的转录调控因子shjg0322参与了井冈霉素生物合成的温度正调控。随后考察了5008和基因shjg0322缺失突变株jg27在37°c培养条件下转录组表达谱变化。在p<0.01,foldchange>4条件下,有51个基因的表达显著下调,21个基因的表达显著上调。这些差异表达的基因与碳代谢、氮代谢以及转录调控密切相关,暗示了shjg0322不但影响了菌株的初级代谢过程,而且参与了某些信号传导通路的调控过程。在差异表达的转录调控基因中,多效性调控基因afss的转录量在37℃培养条件下有4.6倍的下调,并且afss缺失后井冈霉素的产量降低了70%左右。随后的emsa实验表明shjg0322间接通过afss来影响井冈霉素的生物合成,afss也间接参与井冈霉素生物合成。另外,5008在30℃和37℃培养条件下的转录组芯片显示有一个双组分调控基因shjg6961的表达水平在37°c有8.9倍的提高,tl01中基因shjg6961缺失之后井冈霉素的产量下降了31.4%,这个结果暗示了shjg6960/shjg6961可能作为温度感受器参与了井冈霉素生物合成的温度调控。同时,我们发现两个热激蛋白编码基因(shjg4359和shjg8393)、ecfσ因子(shjg4152)以及环境胁迫相关σ因子(shjg2092)的转录水平在37℃高温条件下也有不同程度的提高。基因缺失实验显示基因SHJG4359、SHJG8393、SHJG4152和SHJG2092突变之后,在30℃和37℃发酵条件下井冈霉素的产量都有显著的降低。上述结果暗示井冈霉素生物合成的温度调控信号传导通路可能分支于链霉菌的热激系统,进而影响了井冈霉素的生物合成。