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布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌属(Brucella)的布鲁氏菌引起的一种古老的人畜共患传染病病,该病在世界范围内广泛流行,严重危害公共卫生安全,并造成畜牧业经济巨大损失。巨噬细胞是布鲁氏菌感染宿主后的首要靶细胞,巨噬细胞不仅是宿主体内重要的免疫细胞,也是一种重要的抗原递呈细胞,在清除病原菌、分泌多种细胞因子和对抗原的识别、活化以及免疫调节中扮演着重要的角色,国内外己经有一些研究表明布鲁氏菌感染宿主后具有明显的免疫抑制作用,能够抑制MHC II分子的功能,然而,其相关原因尚不明确。本文主要研究布鲁氏菌侵染巨噬细胞后引起的非典型自噬对MHC II类分子的影响以及布鲁氏菌诱导非典型自噬的可能因素,为研究布鲁氏菌免疫抑制提供新的思路和方法。1.布鲁氏菌16M诱导的非典型自噬对巨噬细胞MHC II表达和递呈的影响。以0.25ng/m L IFN-γ处理的小鼠巨噬细胞、布鲁氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理的小鼠巨噬细胞为实验组,以未处理细胞为对照组,分别作用0 h、4 h、12 h、24 h,实时荧光定量PCR检测胞内MHC II类分子的转录水平;以布鲁氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理过的小鼠巨噬细胞,16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理的稳定表达Atg5、Atg7的GFP-LC3小鼠巨噬细胞为实验组,转染空质粒的GFP-LC3小鼠巨噬细胞为对照组,实时荧光定量PCR检测细胞内MHC II转录水平,激光共聚焦检测细胞内自噬小体和溶酶体的融合率,流式细胞技术检测细胞表面MHC II类分子平均荧光强度和OMP31平均荧光强度。结果,与0.25 ng/m L IFN-γ处理组相比,布鲁氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞,MHC II分子m RNA水平极显著下降(p<0.01);布鲁氏菌侵染稳定表达Atg5和Atg7的GFP-LC3小鼠巨噬细胞后,细胞内MHC II类分子m RNA水平差异不显著(p>0.05),但自噬小体和溶酶体的融合率升高,细胞表面MHC II类分子表达量显著升高(p<0.01)且对OMP31递呈能力显著升高(p<0.01)。实验结果表明布鲁氏菌16M抑制了IFN-γ诱导的MHC II m RNA表达水平;GFP-LC3小鼠巨噬细胞稳定表达自噬相关蛋白Atg5和Atg7,没有改变布鲁氏菌16M对MHC II m RNA的抑制作用,但解除了布鲁氏菌16M对自噬-溶酶体降解途径的阻滞作用,并且显著提高了细胞表面MHC II类分子的表达量和细胞递呈能力。2.布鲁氏菌16M感染巨噬细胞诱导非典型自噬的可能影响因素。以布鲁氏菌16M侵染小鼠巨噬细胞为实验组,未做任何处理的小鼠巨噬细胞为对照组,4 h、12 h、24 h、48h后,通过ELISA抗体双夹心方法检测小鼠巨噬细胞上清液中IL-6的含量;以布鲁氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞、5 ng/m L IL-6和0.25ng/m L IFN-γ处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞、5 ng/m L IL-6处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞为实验组,以布鲁氏菌16M侵染未做任何处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞为对照组,作用4 h,激光共聚焦观察自噬小体标志性蛋白LC3的荧光颗粒;0.25 ng/m L IFN-γ、5ng/m L IL-6分别作用于小鼠巨噬细胞0 min、15 min、30 min、60 min,及0.25 ng/m L IFN-γ和5 ng/m L IL-6共同作用于小鼠巨噬细胞4 h,相对荧光定量PCR检测自噬相关蛋白Atg5和Atg7的表达量。结果布鲁氏菌强毒株16M侵染小鼠巨噬细胞,IL-6细胞因子表达量相比对照组显著升高(p<0.01);且激光共聚焦检测到IFN-γ处理过的小鼠巨噬细胞自噬特异性标签GFP-LC3的荧光颗粒数最多,当IFN-γ的处理中同时加入IL-6时,GFP-LC3的荧光颗粒数减少;相对荧光定量PCR显示随时间增加,IFN-γ上调了Atg7的表达量,当作用30 min时差异显著(P<0.05),作用60 min时差异极显著(P<0.01),IFN-γ对Atg5的表达量没有影响(P>0.05),而IL-6下调了Atg7的表达量,作用15 min时差异显著(P<0.05),作用30 min时差异极显著(P<0.01),IL-6降低了Atg5的表达量,作用60 min时差异显著(P<0.05),当IL-6与IFN-γ共同作用4 h时,IL-6同样表现出对Atg7、Atg5表达量的抑制作用。实验结果表明布鲁氏菌16M能促进小鼠巨噬细胞分泌IL-6,且IL-6抑制了IFN-γ诱导的典型自噬。以上研究结果表明布鲁氏菌16M抑制了IFN-γ诱导的MHC II m RNA表达水平;巨噬细胞稳定表达自噬相关蛋白Atg5、Atg7,没有改变布鲁氏菌16M对MHC II m RNA的抑制作用,但解除了布鲁氏菌16M对自噬-溶酶体降解途径的阻滞作用,并且显著提高了细胞表面MHC II类分子的表达量和细胞递呈能力,表明布鲁氏菌通过诱导非典型自噬对感染的细胞产生免疫抑制作用;布鲁氏菌16M能促进小鼠巨噬细胞分泌IL-6,且IL-6抑制IFN-γ诱导的典型自噬,表明布鲁氏菌可能通过IL-6这一途径干扰IFN-γ诱导的典型自噬从而诱发非典型自噬。