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乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，流行病学资料显示，2000年，在女性恶性肿瘤中，乳腺癌的发生率和死亡率高居首位。在我国，乳腺癌的发病率也在逐年上升。随着乳腺癌发病率的不断增加，对乳腺癌相关基因的研究已成为该领域的热点。于1994年发现的BRCA1基因和1995年发现的BRCA2基因是与乳腺癌发生密切相关的肿瘤易感基因。随着计算机技术和生物信息学的迅猛发展，通过对基因文库的大规模随机测序或利用现有的公共基因数据库资源，进行计算机同源性比较和结构分析，预测可能的生物学功能已成为发现新分子的有效手段。目前，通过各种先进的技术手段，新发现的乳腺癌相关基因日益增多。近十年中已有大量文献报道一些生长抑制因子如转化生长因子β1(TGF-β1)、乳腺抑制素(mammastatin)、神经调节蛋白(NDF)、乳腺源性生长抑制因子(MDGI)和MDGI相关基因(MRG)等具有潜在的抗乳腺肿瘤形成的作用。 本课题组通过对正常人BMSC cDNA文库大规模测序和EST同源比较的方法，首次分离到一条全长1766bp的新型基因(已在GenBank中登录，登录号AY037158)。其cDNA由1434bp的完整开放性阅读框架(ORF)、146bp的5′非编码区(UTR)和186bp的3′非编码区(UTR)组成，其中开放性阅读框架(ORF)编码477个氨基酸，同一读框内起始码ATG上游5′非编码区(UTR)含有一个终止密码子，表明该编码区为一个完整的读框。SOSUI(Signal)和Tmpred软件对推导的蛋白序列进行分析，结果显示该蛋白缺乏信号肽和明显的跨膜区，提示其为一非分泌性蛋白质分子。同源性搜索和比较发现其核酸和氨基酸序列与人源妊娠诱导的生长抑制因子OKL38具有高度的同源性，与大鼠和小鼠妊娠诱导的生长抑制因子同源性也很高，一致性分别为82％和81％，相似性分别为90％和89％。 浙玄〔大肖协币盯创卜习阵位卞仑文月已涛Huynh等研究发现OKL38基因在妊娠和哺乳期的乳腺中高表达，转染OKL38基因的MCF一7稳定表达株在体外的增殖能力以及在裸鼠体内的成致瘤性明显降低。令我们倍感兴趣的是，对从正常人BMSC cDNA文库克隆到的该新基因的研究发现，其具有比OKL38更强的抑制乳腺癌细胞生长的功能，由于该基因为我们首次发现，为一新型的生长抑制因子，故命名为骨髓基质细胞来源的生长抑制因子(旦one Marrow Stromal Cell一少rived少。叭沈h!nhibitor， BDGI)。通过将BDGIcDNA与公共人类基因组数据库进行比较，该基因被定位于人类染色体1 6q23.3，与OKL38基因定位一致，提示BDGI可能是比OKL38更长的剪接体。 通过对新分子的分布研究可能会发现某些特征性分布，从而为其功能研究提供重要的线索。我们利用Northem印迹和RT一PCR对BDGI mRNA在各种成人正常组织、各种细胞系及原代培养细胞中的表达进行了分析。Northem印迹杂交检测结果显示在皋丸、肝脏和骨骼肌等组织中高表达，在脾脏、心脏、肾脏和胰腺等组织中表达量较低，而在胸腺、前列腺、卵巢、小肠、大肠、外周血白细胞、脑、胎盘和肺脏等组织中未能检测到杂交信号。Rl，一PCR分析表明，在新鲜分离的细胞中，BDGI在人BMSC中有表达，而T细胞、B细胞和单核细胞未检测到BDGI的表达:在实体瘤细胞系中，BDGI相对高表达的有CaoV一3、PC一3和Hela细胞系，相对低表达的有SMMC7721和MCF一7细胞系，而在HT29、LoVo、U251和A549细胞系中未检测到BDGI的表达;在造血细胞系中，相对高表达的细胞系有Daudi、K562、Reh和HL一60，相对低表达的细胞系有Raji和Molt一4，而J切rkat和Hut一78细胞系未检测到BDGI的表达。BDGI在各种细胞和细胞系中的分布比较广泛，没有提示特征性的分布。由于BDGI在MCF一7细胞中低表达，我们在后续的研究中，通过转染使BDGI在MCF一7细胞中过表达来研究BDGI的生物学功能。 为了研究BDGI的生物学功能，我们制备了抗BDGI的多克隆抗体，由于BDGI蛋白C端与OKL38相同，我们利用pET24a(+)构建了BDGI编码区N端199氨基酸残基与6His融合的原核重组表达载体pET24a〔十)一BDGI一N，再将重组载体在大肠杆菌BLZI中表达。原核蛋白的高表达使其以包涵体的形式存在，在变性的条件下，通过亲和层析从包涵体中纯化出带有His标签的BDGI一N端片段蛋白，再经透析后用于免疫雌性的新西兰兔，经过两次加强免疫后，获得了亲 浙乞〔大学布成创卜学·位食仑文月已涛和性、滴度较好的抗BDGI血清，该抗血清经过硫酸按沉淀法和A蛋白吸附法纯化后，最终获得较为特异的抗BDGI多克隆抗体。 为了进一步研究BDGI的生物学特性，将BDGI的cDNA克隆到真核表达载体peDNA3.1中，将重组载体转染MCF一7细胞，经800林留nil G418筛选3周后，获得了稳定表达BDGI重组蛋白的MCF一7/BDGI细胞，并通过W七stem印迹对稳定转染株BDGI的表达加以检测(以制备的多克隆抗体为第一抗体，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体)，结果显示，稳定转染株可见一条分子量约为52kDa的条带，而在对照细胞中未能检测到BDGI蛋白的表达。 BDGI与OKL38高度同?