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目的:流行病学研究发现,慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease,CKD）发病率逐年升高,目前成为了世界性难题,研究显示心血管疾病（Cardiovascular Disease,CVD）成为CKD患者首位死因,而血管钙化是心血管疾病发生的独立危险因素。血管中膜钙化是CKD患者血管钙化的主要特征。血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs）作为血管中膜的重要组成成分,研究发现,酸性环境可以抑制血管中膜钙化,但其具体机制尚不明确。本研究探讨酸性环境对慢性肾衰竭大鼠血管钙化的影响及可能机制。方法:1实验分组和模型构建1.1以行5/6肾切除术来构建大鼠慢性肾衰竭的模型,再通过饲喂骨化三醇引起大鼠血管钙化的发生,饲喂NH4CL构建大鼠的慢性代谢性酸中毒的模型。将22只健康雄性SD大鼠,将大鼠随机分成4组,即假手术组（sham;n=6）、慢性肾衰竭组（CKD;n=5）、钙化组（CKD+VC;n=5）和酸干预组（CKD+VC+AC;n=6）。于大鼠的腹主动脉穿刺采血,血气分析测定动脉血pH,动脉血用肝素抗凝,离心后,分离血浆,-80℃冻存备用。取大鼠胸腹主动脉全长,用于组织学观察和钙含量测定。1.2体外细胞实验用10m Mβ-甘油磷酸诱导VSMCs钙化,依据动物实验大鼠血气分析结果,酸干预大鼠动脉血气pH值为7.143±0.163,体外实验为更好模拟体内实验,选定酸干预组pH值为7.1。将VSMCs随机分为4组:（1）正常+pH7.4组（2）高磷+pH7.1组（3）高磷+pH7.4组（4）维拉帕米干预组。2大鼠标本采集与处理5周之后用2%戊巴比妥钠30mg/kg予大鼠麻醉,腹主动脉穿刺,应用血气分析仪检测动脉pH、[HCO3-]浓度,同时采血用Unicel Dxc800全自动生化分析仪检测大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。摘取胸主动脉全段:上段组织保存于液氮用于钙含量检测;下段用10%甲醛固定后石蜡包埋行钙化染色及runx2和LTCCβ3亚基免疫组织化学染色。血管von Kossa钙化染色检测血管钙化情况,钙盐沉积处被染为黑色。血管钙含量测定:邻甲酚酞络合酮比色法测定钙含量,以mg/g为单位。免疫组织化学法检测血管runx2和LTCCβ3表达3各组VSMCs目的基因的表达提取细胞干预4天后正常+pH7.4组、高磷+pH7.1组、高磷+pH7.4组、维拉帕米干预组m RNA,测定L型钙通道（calcium channels,L-type,LTCC）β3亚基和runx2基因的表达。4各组VSMCs目的蛋白的表达Western印迹:L型钙通道（calcium channels,L-type,LTCC）β3亚基和runx2蛋白的表达。5 VSMCs钙化情况及ALP的活性测定细胞钙含量测定:细胞培养14天后弃去上清,BCA法测定细胞蛋白含量,结果用蛋白含量标准化钙含量（mg/g蛋白）。茜素红钙化染色:茜素红（0.1%,pH8.3）染液中37℃温箱赋育30min,结果判断标准:钙盐沉积为橘红色。ALP活性测定:依据ALP活性试剂盒测定ALP活性,结果用蛋白质校准ALP活性。6血管平滑肌细胞内钙离子浓度测定在细胞刺激4天,采用钙离子探针检测VSMCs内钙离子浓度。结果:1体外酸性环境对高磷诱导的VSMCs钙化的影响细胞培养14天后,钙含量结果与钙化茜素红染色一致,与正常+pH7.4组相比,高磷+pH7.4组钙含量明显增多（P<0.05）,钙盐沉积较多;与高磷+pH7.4组相比,高磷+pH7.1组细胞钙含量明显减少（P<0.05）,橘红色钙盐沉积较少。2体外酸性环境对高磷诱导的VSMCs LTCCβ3亚基的表达和细胞外钙离子内流效应的影响RT-PCR和western印记结果显示,高磷+pH7.4组LTCCβ3亚基m RNA表达和蛋白水平较正常+pH7.4组增加（P<0.05）;但是高磷+pH7.1组的表达量明显较高磷+pH7.4组表达减少（P<0.05）。血管平滑肌细胞Fluo-3/AM荧光强度和荧光显色结果显示,与正常+pH7.4组相比,高磷+pH7.4组血管平滑肌细胞荧光强度增加（P<0.05）;与高磷+pH7.4组相比,高磷+pH7.1组胞内的荧光强度下降（P<0.05）。3体外酸性环境对高磷诱导的大鼠VSMCs runx2表达和ALP活性的影响RT-PCR和western印记结果显示保持一致,同正常+pH7.4组相比,高磷+pH7.4组runx2表达水平增加（P<0.05）;与高磷+pH7.4组相比,高磷+pH7.1组表达量明显减少（P<0.05）。ALP活性测定结果显示:酸性环境抑制了ALP活性（P<0.05）。维拉帕米阻断LTCC后,减少细胞内钙离子荧光强度（P<0.05）,抑制高磷诱导的runx2表达（P<0.05）,减少钙盐沉积（P<0.05）。4酸性环境对慢性肾衰竭大鼠主动脉钙化情况比较与假手术组（n=6）大鼠相比,慢性肾衰竭组（n=5）、钙化组（n=5）及酸干预组（n=6）大鼠血肌酐和尿素氮水平均显著增高（P<0.05）;与假手术组、慢性肾衰竭组（n=5）、钙化组（n=5）分别比较,酸干预组大鼠动脉血pH和[HCO3-]水平均下降（P<0.05）。钙含量结果显示,与假手术组相比较,慢性肾衰竭组大鼠主动脉钙含量无明显增高（2.33±0.42vs2.41±0.41,P>0.05）,钙化组大鼠主动脉钙含量显著增高（9.66±1.62vs2.41±0.41,P<0.05）;与钙化组相比,酸干预大鼠主动脉钙含量明显降低（4.83±0.73vs9.66±1.62,P<0.05）。von Kossa染色结果保持一致。5体内酸性环境对慢性肾衰竭大鼠LTCCβ3亚基和runx2在主动脉的表达的影响免疫组织化学结果显示,假手术组和慢性肾衰竭组runx2和LTCCβ3亚基免疫组化评分均低于钙化组（6.20±1.64vs2.16±0.75,6.20±1.64vs3.00±1.00,6.60±2.51vs1.83±0.98,6.60±2.51vs2.60±0.55）,差异有统计学意义（P<0.05）;大鼠体内酸性环境下调runx2和LTCCβ3亚基的表达（6.20±1.64vs3.83±1.33,6.60±2.51vs3.00±1.45,P<0.05）。结论:酸性环境可以抑制VSMCs的钙化,其机制可能是酸性环境通过下调L型钙通道β3亚基表达,阻滞钙离子内流,来起到抗VSMCs成骨成软骨样表型转化的作用。