究背景多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种中老年人较为常见的血液系统恶性肿瘤,大多起源于浆细胞,且发病率较高,发病机制尚不明确。据统计,多发性骨髓瘤在我国的发病率约为1/100000到2/100000,已经超过急性白血病,位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位。近年来,随着我国老龄人口的增多,其发病率也表现出逐年升高的趋势。多发性骨髓瘤主要的病理表现为骨髓中单克隆浆细胞的异常增生和恶性增殖,临床表现主要为溶骨性损伤、高粘血症、贫血、肾功能损害及反复感染等症状,并有骨髓瘤骨病(myeloma bone disease,MBD)等并发症。骨髓瘤骨病是由于多发性骨髓瘤细胞浸润骨髓腔阻碍骨皮质的血液供应,引起弥漫性的骨质疏松和局限性的骨破坏,进一步发展可影响多发性骨髓瘤患者的生存质量和预后。近年来的研究发现,MBD是由于骨吸收增加、新骨生成障碍的骨代谢失衡所导致的并发症。在骨髓微环境中,骨髓基质细胞、MM细胞、破骨细胞(osteoclast,OC)和成骨细胞(osteoblast,OB)都会产生一些细胞因子,这些因子相互作用的结果最终导致破骨细胞活性增强和成骨细胞活性降低,即骨质吸收增加和新骨形成障碍,从而引起骨质疏松和骨质破坏。目前多发性骨髓瘤的主要治疗包括传统化疗和造血干细胞移植。虽然异体基因造血干细胞移植可以治愈部分患者,但是其高死亡率仍然使临床应用受到了很大的限制。传统的化疗和自体干细胞移植可暂时缓解临床症状,但高复发率及多种耐药的产生,使多发性骨髓瘤的治疗目前依然十分困难。近年来,虽然蛋白酶体抑制剂等新型药物的出现和应用一定程度上改善了多发性骨髓瘤患者的预后,提高了他们的生存率,但是多发性骨髓瘤仍然被人们认为是一种无法治愈的疾病。因此进一步深入研究多发性骨髓瘤患者骨溶解的潜在分子生物学机制,寻找和发现抗多发性骨髓瘤的新药或治疗靶点具有十分重要的临床意义。莪术醇(Curcumol,Cur)又称为姜黄醇,是中药莪术(蓬莪术,广西莪术和温郁金的干燥根莲)的挥发油中主要组成成份之一。莪术挥发油中含有68%-70%的莪术醇,是中药莪术抗菌、抗癌和抗病毒等作用的重要物质基础之一。我国传统医学理论认为莪术味辛苦,药性温,入肝经和脾经,具有破血祛瘀和行气止痛的功效。现代医学药理学研究显示,莪术醇具有保肝和抗癌的作用,而且具有低毒和不引起白细胞数减少等优点。近年来有许多研究证实,莪术醇能有效地抑制卵巢癌、肾癌、胆管癌、前列腺癌和肝癌等多种肿瘤细胞的生长,其主要的抗肿瘤机制是诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期。然而,莪术醇对人多发性骨髓瘤细胞的生物学作用研究目前还未见报道。本研究通过基因数据库分析基因表达谱芯片,筛选出了差异表达基因,预测了多发性骨髓瘤患者骨细胞凋亡的潜在分子机制,并通过分子生物学实验和裸鼠荷瘤实验检测了莪术醇对人多发性骨髓瘤细胞的抗肿瘤作用,探讨了莪术醇对多发性骨髓瘤细胞生物学特性的影响及其相应的分子机制,为深入了解多发性骨髓瘤的发病机制,寻找更新、更有效的治疗方案提供理论基础。第一部分多发性骨髓瘤诱导骨细胞凋亡的基因芯片研究研究目的1.分析基因表达谱芯片,筛选出差异性表达基因和相关的信号通路。2.构建蛋白之间相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络图,进一步探讨多发性骨髓瘤患者骨细胞凋亡的分子生物学机制。研究方法1.基于他人前期的芯片结果,我们先从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载有关的表达谱芯片数据,并进行统计学分析。我们的研究对象是GSE27372。此芯片研究的样本共包括6个细胞样本,其中三个是正常的单独培养的成骨细胞,即对照组;另外三个是成骨细胞与人骨髓瘤细胞系JJN3共培养,即共培养组。2.在背景校正、分位数归一化和探针总结后,得到了基因表达矩阵图。采用t检验法分析对照组与共培养组的差异表达基因。对每一个差异性表达基因(Differentially expressed genes,DEG),都满足 P<0.05 和 log2 差异倍数 Fold change>0.58。3.采用Gene Ontology对这些差异性表达基因进行功能注释。KEGG pathway通路富集分析用于分析差异表达基因的主要的生物学功能和所涉及的相关信号通路。4.对于相关功能的差异表达的基因,我们根据TRANSFAC数据库筛选出转录因子,根据TSGene数据库和TAG数据库筛选差异表达基因中的肿瘤相关基因。5.通过在线分析网站STRING对这些差异性表达基因的相互作用进行分析。分别采用 Cytoscape 和 ClusterONE 构建 PPI network 及 sub-network。并利用DAVID在线软件对最重要的sub-network中的基因进行了通路富集分析。研究结果1.差异表达基因的筛选:我们将基因表达谱芯片分成两组,单独培养的骨细胞组和共同培养的骨细胞组。通过分析,我们发现:与对照组相比,共培养组总共有396个差异表达的基因,包括167个表达下调的基因和226个表达上调的基因。2.差异性表达基因涉及的信号通路和生物学功能分析:我们对差异性表达基因相关的信号传导通路和生物学功能进行了富集统计分析。结果发现:下调的基因主要参与心血管系统发育、循环系统发育、蛋白消化及吸收、细胞外基质受体相互作用等过程。需要指出的是,1-磷酸鞘氨醇受体1(sphingosine-1-phosphate receptor1,S1PR1)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和神经肽 Y1受体(neuropeptide Y1 receptor,NPY1R)主要参与循环系统发育过程。另外,上调的基因所涉及的差异性最显著的信号传导通路主要与应激和信号转导功能的调节信号通路相关以及烟酸盐-烟酰胺信号通路,JAK-STAT信号通路。3.转录因子和肿瘤相关基因分析:通过对差异表达的基因进行了分析和分类,我们对其中的转录因子和肿瘤相关基因进行了总结分析。与单独培养的骨细胞组相比,共培养组有4个转录因子的表达显著下调,包括TGFB1I1、NKX2-2、KLF5、ID2;同时18个转录因子的表达明显上调,包括SOX9、SOX7、NR3C2、MSX1、MAFF、KLF4、JUNB、IRF8、HOXB6、HMGA2、HES1、OXF1、FOXA2、ETV5、ETV4、ELK3、EGR3以及EGR1。此外,与单独培养的骨细胞组相比,共培养组有16个肿瘤相关基因的表达下调,包括癌基因RUNX1T1、PDGFRB及CD24以及肿瘤抑制基因TPM1、SPTBN1和PRICKLE1等,同时有21个肿瘤相关基因的表达上调,包括癌基因VEGFA、SPHK1和PDGFRA等和肿瘤抑制基因 SPRY2、SOX7、IRF8 以及 IL24。4.差异表达基因间相互作用:为了研究基因之间的相关性,我们建立了蛋白之间的相互作用网络图(Protein-protein interaction,PPI network)。我们的分析包括89个下调的基因和113个上调的基因。其中关联度大于15的差异表达基因共有10个,包括早期生长反应因子1(early growth response 1,EGR1,degree=19)、表皮生长因子(EGF,degree=31)等。另外值得注意的是,PPI network分析表明EGF与EGR1存在相互作用(P=0.00043)。5.Sub-network 构建:通过 PPI network 的分析,我们构建了 Sub-network(P=0.00043)。Sub-network分析包括9个差异表达的基因,包括S1PR1、complement-3a receptor 1(C3AR1)以及 NPY1R 等。在 Sub-network 中,我们发现S1PR1、C3AR1以及NPY1R三个基因之间之间可以进行相互作用,另外,上调的基因C3AR1和下调的基因S1PR1和NPY1R都参与了神经激活配体-受体相互作用。结论1.差异性表达基因很有可能参与了多发性骨髓瘤MM细胞诱导的骨细胞凋亡。2.这些研究结果为进一步探讨MM患者骨溶解的机制提供理论依据。第二部分莪术醇对体外人多发性骨髓瘤细胞生物学行为的影响及机制研究研究目的1.探讨莪术醇对人多发性骨髓瘤细胞的生物学行为的影响。2.探讨莪术醇影响体外人多发性骨髓瘤细胞生物学行为的信号传导通路及分子机制。研究方法1.对人多发性骨髓瘤细胞株用不同浓度的莪术醇处理,分别于24h、48h、72h、96h后,采用CCK-8方法检测人多发性骨髓瘤细胞株的细胞活力,从而分析不同浓度的莪术醇试剂对人多发性骨髓瘤细胞增殖能力的影响。2.应用流式细胞仪和细胞凋亡检测试剂盒检测不同浓度莪术醇对体外人多发性骨髓瘤细胞的细胞凋亡率的影响。应用Western Blot方法检测不同浓度莪术醇处理人多发性骨髓瘤细胞后,与发生凋亡的相关蛋白Survivin、Bcl-2和Bax的表达变化,分析探讨莪术醇诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的分子生物学机制。3.分别应用流式细胞仪和细胞周期检测试剂盒检测不同浓度莪术醇对体外人多发性骨髓瘤细胞的细胞周期的影响,观察莪术醇对人多发性骨髓瘤细胞周期分布的影响。应用Western Blot方法检测细胞周期相关蛋白p21、p27、cyclinD1的表达,分析探讨莪术醇诱导人多发性骨髓瘤细胞G0/G1周期阻滞的分子生物学机制。4.应用Western Blot方法检测莪术醇对体外人多发性骨髓瘤细胞TLR4/NF-KB信号通路的影响,分析莪术醇抑制人多发性骨髓瘤细胞生长的的分子生物学机制。5.结合前期的芯片数据统计分析的结果,应用定量PCR方法检测莪术醇对某些差异性表达基因的影响,进一步验证这些基因在多发性骨髓瘤诱导骨细胞凋亡过程中发挥的作用。研究结果1.莪术醇对人多发性骨髓瘤细胞增殖能力的影响:不同浓度的莪术醇处理体外人多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226细胞和LP-1细胞达24h、48h、72h、96h后,应用CCK-8方法检测人多发性骨髓瘤细胞的增殖能力。结果表明:莪术醇能明显抑制人多发性骨髓瘤细胞的增殖能力,并且与时间和浓度因素成正相关。2.莪术醇对人多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响:应用不同浓度莪术醇处理RPMI 8226细胞和LP-1细胞后,分别采用流式细胞仪和细胞凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡率。结果表明:莪术醇能明显诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡发生,并且随着莪术醇浓度的增加,其凋亡率显著增加,具有明显的浓度依赖性。应用Western Blot方法检测凋亡相关蛋白的表达,结果:与对照组相比,莪术醇处理组细胞中抗凋亡蛋白Survivin和Bcl-2的表达水平明显下降,而促凋亡蛋白Bax表达则明显升高。3.莪术醇对人多发性骨髓瘤细胞周期的影响:应用流式细胞仪和细胞周期检测试剂盒分别检测不同浓度莪术醇对体外人多发性骨髓瘤细胞的细胞周期的影响。结果显示:与对照组对比,莪术醇处理组细胞周期阻滞在G0/G1期。应用Western Blot方法检测周期相关蛋白的表达,结果表明,莪术醇处理组细胞内cyclinD1蛋白的表达水平明显下调,而p21和p27蛋白的表达则明显上调。4.莪术醇对TLR4/NF-κB信号通路的影响:应用WesternBlot检测莪术醇对人多发性骨髓瘤细胞TLR4/NF-κB信号传导通路中相关蛋白分子的表达,结果显示:与对照组比较,莪术醇处理组细胞中p-NF-κB和TLR4的表达水平明显升高。5.莪术醇对相关基因表达的影响:结合前期的芯片数据统计分析结果,应用定量PCR方法检测莪术醇对某些差异性基因表达的影响。结果:与对照组相比,莪术醇处理48h后,细胞中EGF和S1PR1的mRNA的表达水平明显下调,C3AR1和EGR的mRNA的表达水平明显升高。从而进一步证明了在多发性骨髓瘤诱导的骨细胞凋亡过程中可能发挥重要作用的靶基因。结论1.莪术醇能明显抑制人多发性骨髓瘤细胞的增殖能力,并且与时间和浓度因素成正相关。2.莪术醇通过活化TLR4/NF-κB信号通路促进人多发性骨髓瘤细胞凋亡及诱导G0/G1周期阻滞。第三部分莪术醇抑制人多发性骨髓瘤裸鼠皮下移植瘤的疗效研究研究目的1.探讨莪术醇对人多发性骨髓瘤裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。2.验证莪术醇影响体内人多发性骨髓瘤细胞生物学行为的信号传导通路及分子机制。研究方法1.应用人多发性骨髓瘤细胞接种SCID小鼠构建荷瘤模型,采用不同浓度的莪术醇治疗21天,期间检测肿瘤体积变化。待治疗结束后处死小鼠,称取肿瘤重量并计算抑瘤率。分析和探讨不同浓度莪术醇试剂对人多发性骨髓瘤细胞荷瘤裸鼠模型的肿瘤生长抑制作用。2.应用Western Blot方法检测不同浓度莪术醇试剂对体内人多发性骨髓瘤细胞肿瘤组织中凋亡相关蛋白Survivin、Bax和Bcl-2的表达影响,验证莪术醇诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的分子生物学机制。3.应用Western Blot方法检测肿瘤组织中炎症信号通路相关蛋白TLR4/NF-κB表达水平的变化,验证莪术醇激活TLR4/NF-κB信号通路诱导肿瘤组织产生炎症反应,进而引起肿瘤组织凋亡的分子生物学机制。4.应用定量PCR和Western Blot法检测多发性骨髓瘤肿瘤组织中诱导骨细胞凋亡相关基因S1PR1、EGF、C3AR1和EGR的mRNA和蛋白表达,进一步验证莪术醇对骨髓瘤细胞诱导骨细胞凋亡的相关基因的作用。研究结果1.莪术醇对人多发性骨髓瘤细胞荷瘤小鼠模型肿瘤生长的抑制作用:给予荷瘤小鼠25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg浓度的莪术醇21天。测量肿瘤体积并在实验结束后处死小鼠称量肿瘤重量。结果显示:莪术醇可明显抑制人多发性骨髓瘤的细胞生长,且与药剂浓度呈正相关性。2.莪术醇对肿瘤细胞凋亡相关蛋白表达的影响:应用Western Blot方法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Survivin表达的变化。结果表明:与对照组相比,莪术醇处理组肿瘤组织中抗凋亡蛋白Survivin和Bcl-2的表达水平明显下降,而促凋亡蛋白Bax表达水平明显升高,这一结果与体外实验结果相一致。3.莪术醇对TLR4/NF-KB信号通路的影响:应用Western Blot方法检测肿瘤组织中炎症信号通路TLR4/NF-κB相关蛋白表达水平的变化。结果表明,与对照组相比,肿瘤组织中TLR4和p-NF-κB蛋白的表达水平明显升高。4.在人多发性骨髓瘤移植裸鼠荷瘤模型中,莪术醇对肿瘤组织诱导骨细胞凋亡过程有关基因和蛋白表达的影响:应用定量PCR和Western Blot方法检测多发性骨髓瘤组织中诱导骨细胞细胞凋亡相关基因EGR、C3AR1、EGF和S1PR1的mRNA和蛋白表达情况。结果显示:与对照组相比,莪术醇在人多发性骨髓瘤移植小鼠肿瘤模型中能显著抑制S1PR1和EGF的mRNA和蛋白表达,同时能上调C3AR1和EGR的mRNA和蛋白表达,且具有显著性差异。结论1.在人多发性骨髓瘤细胞荷瘤裸鼠模型中,莪术醇对肿瘤组织的生长具有明显地抑制作用。这种作用可能依赖于激活TLR4/NF-κB信号通路诱导肿瘤组织产生炎症反应,进而引起肿瘤组织凋亡。2.莪术醇可影响细胞凋亡相关基因S1PR1、EGF、C3AR1和EGR的mRNA和蛋白表达,从而影响肿瘤组织诱导骨细胞凋亡。